Метиленово синьо, Nrf2 и митохондриална биогенеза: обяснение

В текстовете за метиленовото синьо често се появява едно изречение: то активира Nrf2 и изгражда нови митохондрии. Изречението звучи като едно твърдение, но съдържа две различни понятия, изследвани в различни системи и подкрепени с различни видове доказателства. Първото е сигнален път — сензор, който включва защитни гени. Второто е програма за изграждане — клетката създава повече митохондриални компоненти. Един сигнал може да задейства изграждането, но да се покаже, че сигналът е подаден, не е същото като да се покаже, че сградата е издигната, а наличието на повече строителен материал не е доказателство за по-добро енергоснабдяване. Тази статия разглежда тези три неща поотделно.

Понятието Nrf2: сензор, а не щит

Nrf2 (ядрен фактор 2, свързан с еритроидния фактор 2) е транскрипционен фактор — белтък, чиято задача е да включва гени. При условия на покой той се задържа в цитоплазмата от сензорен белтък, наречен Keap1, който го предава на клетъчната система за разграждане, така че той непрекъснато се унищожава. Когато оксиданти или електрофили модифицират реактивни цистеинови остатъци в Keap1, разграждането спира. Новосинтезираният Nrf2 се натрупва, преминава в ядрото, образува двойки с малки Maf белтъци и се свързва с ДНК последователности, наречени елементи на антиоксидантния отговор. Това свързване включва цял набор от защитни гени.

Утвърдените показатели за този път са конкретни. NQO1 (NAD(P)H-хинон дехидрогеназа 1) и TrxR1 (тиоредоксин редуктаза 1) са сред най-надеждните прицелни гени на Nrf2. HO-1 (хем оксигеназа-1) се индуцира силно, но реагира и на други регулатори. Ензими като SOD и каталаза са част от антиоксидантния апарат, но нивата им се контролират от много транскрипционни фактори, така че повишаването на SOD само по себе си не доказва, че причината е Nrf2. Най-близките до самото сигнално събитие доказателства са натрупването на Nrf2 в ядрото, активирането на ARE репортер или индуцирането на утвърдени прицелни гени, което изчезва при отстраняване на Nrf2. Всичко останало — по-ниски нива на оксиданти, по-добра преживяемост при стрес, повече глутатион — е последващ ефект, който може да бъде предизвикан от много пътища.

Най-ранният резултат с метиленово синьо в тази история се намира близо до сигналното събитие по тази скала. При фибробласти, изложени на наномоларни концентрации на метиленово синьо, се наблюдава забавено клетъчно стареене заедно с по-високо съдържание на комплекс IV, по-висока консумация на кислород и индуциране на ензимите от фаза 2 TrxR1 и NQO1, както е съобщено в проучването, което за първи път свързва метиленовото синьо с подобрена митохондриална функция и забавено клетъчно стареене. TrxR1 и NQO1 са точно утвърдените прицелни гени на Nrf2, които внимателният читател би искал да види. Проучването обаче не показва самото сигнално събитие: няма измерване на Nrf2 в ядрото, няма ARE репортер, няма контрол с изключен ген за Nrf2. Следователно коректният прочит е, че метиленовото синьо индуцира известни прицелни гени на Nrf2 в тази система, което е съвместимо с активиране на Nrf2, но не установява Nrf2 като причина. Индуцирането на прицелен ген е една стъпка след задействането на превключвателя.

Понятието биогенеза: програма с три контролни точки

Митохондриалната биогенеза е програмата, чрез която клетката увеличава митохондриалния си капацитет. Класическата ѝ йерархия преминава през три контролни точки. Първо, коактиваторът PGC-1alpha включва програмата. Второ, ядрени транскрипционни фактори (объркващо е, че един от тях се нарича NRF1, ядрен респираторен фактор 1 — белтък, различен от Nrf2) стимулират експресията на митохондриални гени, включително TFAM, който поддържа и репликира митохондриалната ДНК. Трето, клетката в крайна сметка разполага с повече митохондриални геноми и повече компоненти на дихателния апарат, измерими чрез броя копия на mtDNA, активността на цитрат синтазата или количеството и активността на дихателните комплекси.

Всяка контролна точка подкрепя твърдение с различна доказателствена сила. По-високите нива на информационната РНК за PGC-1alpha или TFAM показват, че е подадена заявка за програмата, а не че тя е завършена. Повече mtDNA или повече белтък на комплекс IV показват повече материал, но същата картина може да се получи и при преструктурирани митохондрии. Подобреното дишане — по-висока консумация на кислород или активност на комплексите — показва промяна във функцията, но функцията може да се подобри и без никакви нови митохондрии. Силното твърдение за биогенеза съчетава и трите: регулатор, съдържание и функция.

Последващото проучване с фибробласти проследява по-голямата част от тази верига. В човешки клетки IMR90, третирани със 100 наномоларно метиленово синьо, съотношението NAD към NADH се повишава временно в рамките на 15 минути и се връща до изходното ниво в рамките на един ден. Този преходен енергиен сигнал е последван от преходно фосфорилиране на енергийния сензор AMPK, а след това от индуциране на PGC-1alpha и SURF1 — белтък, необходим за сглобяването на функциониращ комплекс IV. Активността на комплекс IV се увеличава приблизително двойно, клетъчните оксиданти намаляват с около 28 процента, а теломерите се скъсяват по-бавно. Пълната последователност е изложена в публикацията, която свързва окислително-редукционната активност на метиленовото синьо с AMPK и митохондриалната биогенеза.

Две подробности в тази публикация заслужават внимание, защото именно такива подробности обикновено се пропускат. Първо, моделът на активиране е по-важен от самото му наличие: метиленовото синьо включва AMPK временно, докато референтното лекарство AICAR го включва продължително, а преходният активатор забавя клетъчното стареене около осем пъти по-ефективно. Следователно твърдение от вида „метиленовото синьо активира AMPK“ е непълно; същественото е, че то активира AMPK временно, а сравнението подсказва, че продължителното активиране не постига същия ефект. Второ, метиленовото синьо не променя клетъчния цикъл, което изключва най-тривиалното алтернативно обяснение — че клетките просто се делят по-бавно и затова изглеждат по-млади.

Направлението с мишки: поведение, геноми и умишлено парадоксален пусков механизъм

Работата с клетъчни култури е разширена към животни от група, изследваща мишки на средна възраст. След 60 дни перорален прием на метиленово синьо третираните мишки запазват в по-голяма степен физическата си издръжливост и изследователското си поведение и проявяват по-малко поведение, наподобяващо тревожност, в сравнение с нетретирани възрастни мишки. В мозъчната тъкан експресията на гени, потисната от стареенето — NRF1, TFAM, SOD2 и COX1, кодиращ субединица на комплекс IV — се възстановява към нивата при зрели животни, а броят копия на mtDNA нараства. Тези резултати — поведение плюс регулатор плюс количество геноми — са представени в проучването с мишки на средна възраст за метиленовото синьо и митохондриалната биогенеза в мозъка.

Предложеният пусков механизъм е интересната част, защото противоречи на опростеното обяснение, че метиленовото синьо е антиоксидант. При третираните мишки се наблюдава повишено образуване на реактивни кислородни видове в мозъчните митохондрии, по-конкретно на водороден пероксид. Хипотезата на авторите е, че слаб пероксиден сигнал активира пътя на Nrf2, който след това задейства програмата за биогенеза. В този модел метиленовото синьо е прооксидант на етапа на задействане и антиоксидант на етапа на крайния резултат — модел, който фармаколозите наричат хормезис, при който лек стрес предизвиква защитен отговор, по-силен от самия стрес. Дали това повишаване на пероксида действително причинява активирането на Nrf2, не е проверено пряко; то е предполагаемата връзка, а не измерена зависимост.

Съпътстващо проучване на същата група подлага на проверка аспекта на безопасността в тази хипотеза. В изолирани мозъчни митохондрии метиленовото синьо повишава образуването на водороден пероксид при концентрации от едва 50 наномолара, но терапевтичните концентрации не причиняват откриваемо увреждане на митохондриалната ДНК. Едва при 100 микромолара, далеч над терапевтичните нива, определени фрагменти от mtDNA показват увреждане, а комбинацията от 20 микромолара багрило с червена светлина образува синглетен кислород, който уврежда mtDNA в широк мащаб — известното поведение на багрилото като фотосенсибилизатор, а не фармакологичното му действие на тъмно. Предварителното третиране дори предпазва митохондриите във вентралната част на средния мозък от предизвикани от ротенон увреждания на mtDNA. Зависимостта доза–отговор и контролните проверки за генотоксичност са подробно описани в проучването за негенотоксичното образуване на пероксид под въздействието на метиленово синьо.

Измерено срещу предполагаемо: как да четем диаграмата

Диаграмата на пътищата по-долу е създадена за тази статия, за да подчертае разграничението, което текстът прави. Полетата с плътни очертания представят стъпки с пряка експериментална подкрепа в литературата за метиленовото синьо: окислително-редукционно циклиране, което променя NAD/NADH, преходно фосфорилиране на AMPK, индуциране на PGC-1alpha и SURF1, по-висока активност на комплекс IV, индуциране на NQO1 и TrxR1, възстановена експресия на гените за биогенеза и брой копия на mtDNA в мозъка на мишки, както и повишаване на пероксида без увреждане на mtDNA при терапевтични дози. Полетата с прекъснати очертания представят предполагаемите връзки: разпознаване на пероксидния сигнал от Keap1, натрупване на Nrf2 в ядрото, което задейства защитните гени, и причинната стрелка от активирането на Nrf2 към програмата за биогенеза. Тези стъпки с прекъснати очертания са правдоподобни, съвместими с данните и част от стандартните знания по биология, но в тези публикации не са измерени с контролните проверки (ядрен Nrf2, ARE репортери, изключване на гена за Nrf2), които биха позволили да бъдат представени с плътни очертания.

Когато диаграмата е пред вас, стават видими три източника на объркване. Първо, NRF1 и Nrf2 са различни белтъци с почти еднакви имена; проучването с мишки измерва ядрения респираторен фактор 1, регулатор на биогенезата, а не антиоксидантния транскрипционен фактор, и смесването им свежда цялата диаграма до един-единствен възел. Второ, генната експресия е началото на историята, а не краят; възстановените нива на информационната РНК за TFAM или COX1 подкрепят наличието на заявка за биогенеза, докато броят копия на mtDNA и активността на комплекс IV са доказателствата, че заявката е изпълнена. Трето, антиоксидантният краен резултат не доказва участие на пътя на Nrf2; намаляването на оксидантите с 28 процента във фибробластите и защитата срещу ротенон при мишките са реални последващи ефекти, но до тях водят няколко различни пътя.

Какво би превърнало поле с прекъснати очертания в поле с плътни очертания

Липсващите експерименти са стандартни. Измерване на белтъка Nrf2 в ядрото след излагане на метиленово синьо, с времево проследяване, съобразено с преходния сигнал на AMPK, би проверило дали двете направления действително се задействат едновременно, както твърди хипотезата за синхронизирано активиране. Репортер, управляван от ARE, би потвърдил транскрипционната активност, вместо тя да се извежда косвено от прицелните гени. Повтарянето на измерванията за биогенеза при потисната експресия или изключен ген за Nrf2 би проверило пряко причинната стрелка: ако индуцирането на комплекс IV и увеличаването на mtDNA се запазят без Nrf2, предполагаемата връзка е погрешна и направлението на AMPK само по себе си обуславя ефекта. При животните проучване с продължително прилагане и същите три контролни точки — регулатор, съдържание, функция — би проверило дали програмата остава включена, или се адаптира. Дотогава синхронизираното активиране на енергийните и защитните пътища остава това, което авторите му са го нарекли: възможен ключов фактор, а не установен механизъм.

Читателите, които подхождат от гледна точка на по-широката фармакология, може да потърсят и съпътстващия контекст: как метиленовото синьо пренася електрони на митохондриално ниво, какво друго прави с митохондриите и клетъчната енергия, какво място заемат резултатите за клетъчното стареене в изследванията на стареенето, как твърденията за биогенеза се отнасят към когнитивното представяне и как данните за безопасност очертават границите на всяко обсъждане на дозиране. Всяко от тези е отделно понятие със собствени доказателства и всяко заслужава същото разграничаване между измерено и предполагаемо, което тази статия приложи към Nrf2.