Измерване на митохондриалните ефекти на метиленовото синьо: кислород, ATP и мембранен потенциал

Да предположим, че лаборатория добавя метиленово синьо към митохондрии с нарушено дишане и наблюдава повишаване на кислородната консумация. Естественото заключение е, че багрилото е възстановило митохондриалната функция. Това заключение може да е погрешно. Кислородният поток, синтезът на ATP и мембранният потенциал са три отделни понятия. Те се отнасят до една и съща органела така, както архивирането, синхронизирането и споделянето се отнасят до една и съща папка в облака: свързани са, но се подчиняват на различни правила. Ако объркате едното с другото, интерпретацията се проваля, дори когато всяко измерване е технически правилно.

Метиленовото синьо прави това объркване вероятно, защото участва в системата, която измерва. То преминава през редокс цикли, като приема електрони на по-ранен етап и ги отдава на по-късен етап от веригата; представлява липофилен катион, който се натрупва в енергизирани митохондрии; и е интензивно синьо съединение, което поглъща и излъчва светлина в същите спектрални области като широко използвани сонди. Един-единствен показател не може да обхване всичко това. Надеждният подход, демонстриран в митохондриалните изследвания на групата от Будапеща, е да се измерват кислородният поток, скоростта на синтез на ATP, мембранният потенциал и отделянето на водороден пероксид, със специфични за багрилото контроли на всяка стъпка.

Респирометрията измерва кислородния поток, а не енергийния добив

Респирометрията с висока разделителна способност, независимо дали се извършва с Oroboros Oxygraph или с анализатор на извънклетъчни потоци Seahorse, показва едно: колко бързо се редуцира кислородът. Тя не показва колко протона са изпомпани на електрон, каква част от градиента е запазена или дали ATP синтазата го е използвала.

Терминологията е важна. При изолирани митохондрии субстратът без ADP дава дишане, свързано с протонно изтичане, субстратът с насищаща концентрация на ADP дава капацитета за окислително фосфорилиране, а титруването с разединител дава максималния капацитет за електронен пренос. При интактни клетки съответните показатели на Seahorse са базално дишане, чувствително към олигомицин дишане, свързано с ATP, протонно изтичане, максимално дишане, определено с FCCP, и немитохондриална кислородна консумация, устойчива на ротенон и антимицин. Назоваването на показателите от Seahorse „състояние 3“ и „състояние 4“ им приписва точност, която препаратът не позволява, както ясно показва методологичната рамка на Agilent Mito Stress Test.

Метиленовото синьо нарушава интуитивната връзка между повече кислород и повече енергия. При изолирани мозъчни митохондрии от морски свинчета багрилото в концентрации от 100 nM до 1 uM повишава кислородната консумация в покой при субстрати глутамат плюс малат, сукцинат и алфа-глицерофосфат, с увеличение от приблизително 64 процента при алфа-глицерофосфат. Същевременно стимулираното от ADP дишане в здрави митохондрии остава практически непроменено според изследването с изолирани мозъчни митохондрии. Тъй като дишането, свързано с протонно изтичане, се повишава, а стимулираният от ADP поток остава непроменен, изчисленият коефициент на дихателен контрол намалява. Това намаление не означава, че багрилото е увредило митохондриите. То означава, че багрилото е добавило редокс цикъл, консумиращ кислород, към нормалното дишане. Анализ на кислородната консумация с метиленово синьо, който отчита само повишението, е измерил реален химичен процес, но не е казал нищо за съхраняването на енергията.

Експериментите за възстановяване показват същото разминаване в по-голям мащаб. При блокиран комплекс I кислородният поток се възстановява приблизително трикратно, докато синтезът на ATP се възстановява само около 1.5 пъти. До електрода достига повече кислород. По-малка част от него допринася за синтеза на ATP. Всяко твърдение за подобрено окислително фосфорилиране трябва да включва и данните за ATP, в идеалния случай изразени като съотношение ATP към кислород с изрично посочена конвенция за знаменателя.

Анализите за ATP измерват скоростта на синтез, която съдържанието не може да замести

Анализът за ATP отговаря на различен въпрос: колко ATP се образува за единица време. Кинетично измерване — чрез луминисценция на луцифераза от светулка, проследявана в продължение на минути, или чрез спрегнат анализ с хексокиназа и глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа, отчитан при 340 nm — дава скорост. Еднократното измерване на общия ATP в крайна точка дава съдържание, което отразява синтеза минус консумацията и само по себе си казва малко за окислителното фосфорилиране.

Групата от Будапеща използва спрегнатия ензимен метод с потисната аденилаткиназа и установява, че метиленовото синьо при 1 до 2 uM повишава умерено, но значимо, продукцията на ATP в митохондрии, третирани с ротенон и с антимицин. Това е реално възстановяване и то е частично. Изследването на токсичността на TEGDMA достига до сходен резултат в различен модел: 5 mM от денталния мономер TEGDMA понижава рязко дишането, свързано с комплекс I, от приблизително 286 на 28 единици поток, а 2 uM багрило го възстановява до приблизително 86.

Две контроли са задължителни при оцветено редокс съединение. Първо, използвайте олигомицин, за да установите каква част от измерения синтез на ATP зависи от ATP синтазата. Второ, проведете безклетъчен тест за възстановяване на известна добавка на ATP, като използвате известно количество ATP, пълния реагентен състав и точно същите концентрации на багрилото — най-малко 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM и 2 uM. Багрилото може да поглъща излъчената светлина, да инхибира репортерния ензим или да променя редокс химията на реагентите, а общите насоки за луциферазни анализи препоръчват биохимични контраскринингови тестове именно за този клас смущения. Не приемайте, че при 1 uM няма артефакти само защото гасенето обикновено е по-силно при по-високи концентрации.

Сондите за мембранен потенциал измерват разпределението на багрилото, а не потока

Сафранин O, TMRM и TMRE, родамин 123 и JC-1 са катиони, които преминават през мембраните. Те се натрупват в отрицателно заредения матрикс според електрохимичното равновесие, така че общата флуоресценция отчита потенциала косвено чрез местоположението на сондата. Нито една от тях не измерва ATP или електронния поток.

Всяка сонда има предпочитан тип препарат. Сафранин O е подходящ за изолирани митохондрии и пермеабилизирани клетки, обикновено при около 2 uM, с възбуждане около 495 nm и емисия около 585 nm, в режим на гасене, при който натрупването променя общата флуоресценция. TMRM и TMRE са подходящи за интактни клетки при зареждане с ниски наномоларни концентрации в режим без гасене, при който деполяризацията освобождава багрилото и митохондриалната флуоресценция намалява; при високо зареждане посоката на сигнала може да се обърне поради самогасене. JC-1 дава удобно съотношение между зелен и червен сигнал, но зависи от зареждането и митохондриалната маса, което го прави по-слаб избор за количествени изследвания от внимателно контролирания TMRM. Тези компромиси са обобщени в широко използван обзор на сондите за митохондриален мембранен потенциал.

Метиленовото синьо предизвиква оптични смущения именно при работните концентрации. Абсорбционните му ивици около 600 до 665 nm се припокриват с червената емисия на сондите, така че ефектите на вътрешния филтър, гасенето и поглъщането на възбуждащата светлина са напълно възможни. Багрилото е и втори липофилен катион, чието собствено разпределение се променя с измервания потенциал. Защитата е съчетание от независими измервания и празни проби: само сонда, само багрило, сонда с всяка концентрация на багрилото, пълна деполяризация с FCCP като нулева референтна точка и, в идеалния случай, втора сонда с различни оптични характеристики. Изследването на заобикалянето на комплекс III създава този прецедент, като повтаря възстановяването на мембранния потенциал със сафранин O и с TMRM след инхибиране с антимицин и миксотиазол и получава едно и също качествено възстановяване. Един оптичен репортер е индикация. Два независими репортера са доказателство.

Три типа препарати, три различни въпроса

Изолираните митохондрии, пермеабилизираните клетки и интактните клетки не са взаимозаменяеми настройки за чувствителност на един анализ. Те са различни подходи с различни принципи на работа.

Изолираните митохондрии запазват електроннотранспортната верига, вътрешната мембрана и функционалния апарат на матрикса, но премахват плазмената мембрана, цитозола и мрежовата организация. Именно това отстраняване е целта: субстратите, ADP, инхибиторите и концентрациите на багрилото са точно определени, което позволява да се идентифицира конкретен път. Цената е загубата на естественото снабдяване със субстрати, сигнализацията и енергийните потребности.

Пермеабилизираните клетки запазват митохондриите в голяма част от клетъчната им организация, като същевременно пропускат екзогенни субстрати и ADP през отворената плазмена мембрана. Те са подходящият инструмент за локализиране на дефект в субстратен път в клетъчен контекст. Прекомерната пермеабилизация уврежда външната мембрана, а цитозолната регулация се губи при отмиването.

Интактните клетки запазват всичко: бариерата на плазмената мембрана, цитозолните редуктори, ендогенния транспорт на субстрати, митохондриалната мрежа и потребността от ATP. Те са най-близо до физиологията и най-далеч от механизма, защото поемането, редукцията и задържането на багрилото определят ефективната митохондриална експозиция.

Изследването с TEGDMA целенасочено използва и трите нива: изолирани мозъчни митохондрии за възстановяването на окислението и потенциала чрез багрилото; пермеабилизирани стволови клетки от зъбната пулпа главно за локализиране на нарушението в окислението на субстрати, свързано с комплекс I; и интактни стволови клетки за нетния физиологичен ефект на 2 uM багрило върху потиснатата кислородна консумация. За читателите, които сравняват митохондриални показатели между различни препарати, съпътстващата обяснителна статия за това как метиленовото синьо пренася електрони през дихателната верига предоставя контекст за пътищата, а ръководството за четене на изследвания върху дишането с метиленово синьо разглежда логиката на концентрациите и инхибиторите.

Контроли, които изисква едно редокс-активно багрило

Съединение, което преминава през редокс цикли, се нуждае от по-дълъг списък с контроли от обикновен инхибитор, защото химичните реакции само на багрилото могат да имитират биологични процеси.

За респирометрията използвайте камера само с буфер за отчитане на дрейфа, камера с буфер и багрило без биологичен материал, багрило с всеки извънклетъчен редуктор, присъстващ в анализа, и накрая ротенон плюс антимицин за определяне на немитохондриалната кислородна консумация в интактни клетки. Имайте предвид, че редуцираното багрило се окислява отново чрез пренос на електрони към кислорода с образуване на водороден пероксид. Затова празна проба само с багрило, без електронен донор, подценява безклетъчната консумация на кислород, която се появява при наличие на NADH или NADPH.

За водородния пероксид предпочитайте калибриран Amplex UltraRed плюс пероксидаза от хрян пред неселективните багрила DCFDA, потвърждавайте с каталаза и проверявайте зависимостта от осветяването, тъй като багрилото е фотосенсибилизатор. Изследването с мозъчни митохондрии установява, че пероксидното натоварване се повишава повече от четирикратно при едва 100 nM багрило, докато отстраняването се забавя, като пероксидът се образува директно от редуцираното багрило без супероксиден междинен продукт. Подробностите за избора на сонди и контролите за светлина са разгледани в съпътстващата статия за измерване на реактивните кислородни видове в експерименти с багрила, а по-общият въпрос кога пероксидът действа като сигнал и кога като натоварване е разгледан заедно с клетъчния редокс баланс и твърденията за антиоксидантно действие.

За твърдения относно пътищата тествайте и двете места на инхибиране на комплекс III: антимицин A в мястото Qi и миксотиазол в мястото Qo, плюс крайна проверка на комплекс IV с цианид. По-ранно изследване с мозък от мишки съобщава за възстановяване чрез багрилото на дишане, блокирано с ротенон, но не и с антимицин, докато по-късното изследване с три вида установява частично възстановяване с двата инхибитора и доказателства за директна редукция на цитохром c. Приемайте заобикалянето като съвместимо с по-новите данни, а не като окончателно установено, тъй като концентрацията на багрилото, мястото на действие на инхибитора, субстратните условия и разпределението на багрилото променят наблюдавания път.

Матрица за избор на анализ

Използвайте тази таблица, за да изберете измерването според въпроса, а не обратното.

За минимално убедително твърдение едни и същи концентрации на багрилото — 100 nM, 300 nM, 1 uM и 2 uM — трябва да бъдат използвани при измерване на кислородния поток в условия на протонно изтичане, с ADP, с олигомицин и с разединител; на скоростта на синтез на ATP; на мембранния потенциал, за предпочитане с две сонди; и на калибрираното отделяне на пероксид с контроли с каталаза и безклетъчни контроли. Представете свързания набор: кислороден поток плюс скорост на синтез на ATP плюс ATP на кислород плюс потенциал плюс пероксид. Всяко от тези числа поотделно е измерване, което търси своя смисъл.