Метиленово синьо и азотен оксид: NOS, cGMP и съдова сигнализация

Въпросът звучи просто: инхибира ли метиленовото синьо азотния оксид? В лабораторията отговорът се разделя на четири отделни въпроса и всеки изисква различен експериментален тест. Смесването им е основната причина текстовете за метиленовото синьо и азотния оксид да звучат уверено, но неясно.

Представете си сигнала на азотния оксид като верига с четири звена. Ген се транскрибира, за да се произведе азотен оксид синтаза. Ензимът превръща аргинина в азотен оксид. Газът дифундира до своята мишена, преди да реагира с нещо друго. Разтворимата гуанилатциклаза го разпознава и произвежда цикличен GMP. Публикувани са ефекти на метиленовото синьо върху всяко звено, но доказателствата идват от различни експериментални препарати, различни концентрации и различни изоформи. Резултатът при едно звено не доказва действие при друго.

Каноничната верига, обяснена ясно

В стената на кръвоносен съд стандартната последователност е следната. Стимул действа върху ендотелна клетка. Ендотелната азотен оксид синтаза, наричана eNOS или NOS3, произвежда малък импулс азотен оксид. Газът дифундира в съседната гладкомускулна клетка, свързва се с хема с редуцирано желязо на разтворимата гуанилатциклаза и ускорява превръщането на GTP в цикличен GMP. Цикличният GMP активира протеинкиназа G, регулацията на калция се променя и мускулът се отпуска.

Има и втора верига, която е важно да се разглежда отделно. При инфекция или излагане на цитокини клетките транскрибират гена за различен ензим — индуцируемата азотен оксид синтаза, или iNOS, наричана още NOS2. Тя произвежда по-големи и по-продължителни потоци азотен оксид от eNOS. Трета изоформа, невроналната NOS, или nNOS, принадлежи към още един контекст. Когато статия споменава азотен оксид синтаза, без да уточнява изоформата, спрете и проверете коя е измерена. Обзорът за това как метиленовото синьо пренася електрони прави същото уточнение за редокс мишените като цяло: преносителят не действа самостоятелно, а партньорът във всеки край определя резултата.

Измереният цикличен GMP също е обобщен показател, а не пряк тест за ензимна активност. Нивото му отразява синтеза от циклазата минус разграждането от фосфодиестерази, особено PDE5 в съдовата гладка мускулатура. Следователно спадът на цикличния GMP означава, че до детектора е достигнал по-слаб сигнал. Сам по себе си той не показва кое звено е отказало.

Звено 1: произвежда се по-малко ензим iNOS

В миши макрофаги, стимулирани с бактериален липополизахарид, интерферон гама или и с двете, метиленовото синьо предотвратява очакваното увеличение на белтъка iNOS и силно потиска информационната РНК за iNOS в експериментите върху транскрипцията в макрофаги. Показателно е какво не се променя. Разграждането на инхибитора I капа B алфа, фосфорилирането на NF капа B и STAT1 и преместването на тези фактори в ядрото остават до голяма степен незасегнати. Намалява свързването им с ДНК, потвърдено чрез хроматинова имунопреципитация, която показва по-слабо заемане на промотора на iNOS.

Това е ефект върху генната регулация, предхождащ промяната в количеството ензим, а не остро блокиране на съществуващ ензим. Той се отнася до възпалителната сигнализация, при която транскрипционните фактори трябва да се свържат с промотор, преди да се появи белтъкът. Това не дава пряка информация за конститутивната eNOS в съд в покой и трябва да се описва именно така.

Звено 2: съществуващият ензим NOS работи по-бавно

Изследване върху плъхове проверява друго ниво. На мъжки плъхове в съзнание е приложен интравенозно липополизахарид, а три часа по-късно — физиологичен разтвор или метиленово синьо в доза 3 mg на kg интравенозно. Активността на азотен оксид синтазата в медиалния базален хипоталамус е измерена чрез превръщането на белязан аргинин в цитрулин в изследването на хипоталамичната активност на NOS. Само стресът заедно с физиологичен разтвор предизвиква известна калций-независима активност, а липополизахаридът я повишава до около десет пъти над контролното ниво. Метиленовото синьо премахва и двата индуцирани компонента. Калций-зависимата конститутивна активност не се променя в тази тъкан при тази доза и в този момент на измерване.

Прочетете резултата точно както е формулиран: потисната измерена активност от типа iNOS при тези условия. Това не е измерване на генната експресия и не е доказателство за постоянна селективност към iNOS спрямо eNOS или nNOS. Работата с пречистени ензими подчертава нуждата от предпазливост. При преки тестове на пречистена азотен оксид синтаза метиленовото синьо напълно блокира образуването на цитрулин при 30 микромолара, с концентрация за полумаксимално инхибиране около 5.3 микромолара без супероксиддисмутаза и 9.2 микромолара с нея, както е съобщено в сравнението на пречистени NOS и гуанилатциклаза. Отделно изследване на пречистена nNOS свързва ефекта с окисляване на хема, свързан с ензима. Практическият извод е, че прякото инхибиране на NOS е реално в изолирани системи, но резултатът от хипоталамуса не може да се разширява до общо твърдение, че метиленовото синьо оставя незасегнати всички конститутивни NOS навсякъде.

Звено 3: азотният оксид се губи, преди да пристигне

Най-ясната демонстрация, че спадът на цикличния GMP може да се обясни с нещо различно от блокиране на ензим, идва от култивирани гладкомускулни клетки от белодробна артерия на заек. Експерименталната постановка изцяло заобикаля ендогенната NOS чрез пряко добавяне на донори на азотен оксид, след което проверява дали метиленовото синьо все пак потиска отговора на цикличния GMP в изследването на супероксида в съдовата гладка мускулатура.

Тествани са три донора при концентрации от 1 до 100 микромолара: S-нитрозо-L-цистеин, натриев нитропрусид и стабилен дезаминиран аналог, наречен MPANO. Всички повишават цикличния GMP приблизително от 1.5 до 12 пъти. Метиленовото синьо при 10 микромолара потиска отговора към първите два с 51 до 100 процента и оставя отговора към MPANO непроменен. Ако метиленовото синьо просто блокираше каталитичния център на циклазата, тази селективност спрямо донора би била трудна за обяснение, защото и трите действат чрез един и същ ензим надолу по веригата.

След това три контролни опита свързват механизма със супероксида. Първо, генерирането на извънклетъчен супероксид чрез ксантин и ксантиноксидаза възпроизвежда същия модел: отговорите към CYSNO и нитропрусид са блокирани, а този към MPANO остава незасегнат. Второ, метиленовото синьо предизвиква зависимо от дозата и времето производство на супероксид от гладкомускулните клетки, измерено чрез редукция на цитохром c. Трето, супероксиддисмутазата напълно предотвратява инхибирането, докато каталазата не го предотвратява, което сочи супероксида, а не водородния пероксид, като непосредствено действащия химичен вид в този препарат.

Вариантът на експеримента със съвместно култивиране заслужава описание, защото локализира ефекта в пространството. Ендотелни клетки върху покривни стъкла са култивирани за кратко съвместно с гладкомускулни клетки, така че базално освобождаваният ендотелен фактор повишава цикличния GMP в гладката мускулатура от три до осем пъти. Предварителното третиране на който и да е от двата клетъчни компартмента с метиленово синьо намалява този сигнал, а супероксиддисмутазата частично възстановява сигнала след предварително третиране на ендотелните клетки. С други думи, изобщо не е необходимо метиленовото синьо да действа вътре в гладкомускулната клетка, която улавя сигнала. То може да намали сигнала, като отстрани посредника по време на преноса му. Ръководството за четене на изследвания върху метиленовото синьо разглежда това като общо правило: посочете компартмента, в който е извършена намесата, преди да назовете молекулна мишена.

Би било неправилно това да се нарича инхибиране на NOS. За действието на донорите не е необходим етап със синтаза, но сигналът въпреки това намалява.

Звено 4: самият детектор реагира по-слабо

Съществуват преки ефекти върху разтворимата гуанилатциклаза, но концентрациите имат значение. В цитираното по-горе сравнение на пречистени ензими за полумаксимално инхибиране на стимулираната от азотен оксид циклаза са необходими около 60 микромолара метиленово синьо, спрямо около 5 до 9 микромолара за полумаксимално инхибиране на NOS, а дори 1 милимолар води само до частична максимална блокада. Това е разлика от приблизително шест до единадесет пъти. Следователно клетъчен експеримент при ниска микромоларна концентрация, който понижава цикличния GMP, не може да бъде определен като селективно инхибиране на циклазата само въз основа на стойността на цикличния GMP.

По-късно редокс изследване добавя второ предупреждение: метиленовото синьо дезактивира активираната от азотен оксид циклаза чрез механизъм, различен от простото окисляване на хемовото желязо от въздуха. Следователно функцията на детектора може да бъде нарушена, но химичният механизъм не е изяснен, а разликата в концентрациите означава, че при ниски микромоларни експозиции първо трябва да се изключат ефектите на супероксида и върху NOS. Тук е мястото и на контрола за фосфодиестеразна активност. Ако разграждането не е измерено или блокирано, намаленото натрупване на цикличен GMP е съвместимо с по-слаб синтез, по-бързо разграждане или и с двете.

Защо това не се свежда до едно твърдение за кръвното налягане

Всяко звено е установено в различна система. Транскрипцията в макрофаги не е ензимна активност в хипоталамуса. Хипоталамичната активност след липополизахарид не е ендотелен тонус в покой. Базално освобождаваният ендотелен фактор при съвместно култивиране не е стимулирана от агонист вазодилатация. Култивирани клетки от белодробна артерия при 10 микромолара метиленово синьо не са човешко кръвообращение. Свеждането на всичко това до твърдение като „метиленовото синьо повишава кръвното налягане чрез блокиране на азотния оксид“ отхвърля точно онези разграничения, за чието запазване са създадени контролните опити.

Три проверки поддържат изложението коректно. Първо, посочете изоформата: eNOS за съдовия тонус в покой, iNOS за индуцирания поток при възпаление, nNOS за невроналния контекст и някои експерименти с пречистени ензими. Второ, посочете как се подава сигналът на азотния оксид: ендогенен синтез, базално ендотелно освобождаване или конкретен донор като CYSNO, нитропрусид или MPANO, тъй като стабилният донор устоява на метиленовото синьо, а лабилните — не. Трето, посочете концентрацията и възстановяването на сигнала: възстановяването чрез супероксиддисмутаза насочва към участие на супероксида, липсата на ефект от каталазата е аргумент срещу водородния пероксид в този препарат, възпроизвеждането на ефекта чрез ксантиноксидаза показва, че механизмът е достатъчен, а тестовете с пречистени ензими разграничават преките ефекти върху катализата от загубите по време на преноса.

Краткото обобщение е следното. По-правилно е метиленовото синьо да се разглежда като вещество, което нарушава сигнализацията от азотен оксид към цикличен GMP на множество места, отколкото като селективен блокер на циклазата. В зависимост от експерименталния препарат и концентрацията то може да намали свързването на транскрипционните фактори за iNOS, пряко да инхибира ензимите NOS, да намали наличността на азотен оксид чрез генериране на супероксид и да наруши функцията на активираната от азотен оксид циклаза. Ролята на сигнализацията чрез цикличен GMP в съдовите изследвания и сравнението на донорите на азотен оксид, използвани в клетъчни тестове разглеждат по-подробно отделни клонове от тази верига, а методите за разграничаване на редокс ефектите от ензимните ефекти обясняват защо комбинацията от супероксиддисмутаза, каталаза и контрол със стабилен донор се среща толкова често в тази литература.

Ниската стойност на цикличния GMP след метиленово синьо показва прекъсната верига. Само контролните опити показват кое звено се е прекъснало.