Метиленово синьо и автофагия: AMPK, mTOR и експерименти с невронални клетки

Представете си, че провеждате клетъчен експеримент, добавяте метиленово синьо и виждате как белтъчна ивица, наречена LC3-II, става по-тъмна на имуноблота. Изкушаващо е да обявите, че съединението „засилва автофагията“, и да продължите нататък. Това тълкуване е преждевременно. По-тъмната ивица на LC3-II може да означава, че клетката образува повече везикули за почистване, но може и да означава, че везикулите се натрупват, защото етапът на разграждане е блокиран. Двете тълкувания водят в противоположни посоки, а литературата за метиленовото синьо в невронални модели съдържа примери за доказателства и от двата вида. Тази статия разглежда какво всъщност е измерено, анализ по анализ.

Макроавтофагията, изследваната тук форма, е клетъчният механизъм за рециклиране на големи количества материал. Мембранна торбичка, наречена фагофор, обгръща износени белтъци и органели, затваря се в автофагозома, слива се с лизозома, а съдържанието ѝ се разгражда и освобождава за повторна употреба. Невроните зависят от този процес, защото не се делят и не могат да разреждат увредените си компоненти чрез делене. Когато рециклирането спре, отпадъците се натрупват. Когато протича, клетката възстановява градивни компоненти в условия на стрес.

Какво показва един експеримент с хипокампални клетки

Основното изследване на индуцирането използва миши хипокампални клетки HT22, подложени на стрес чрез лишаване от серум за 24 часа — условие, което отнема растежните фактори и трофичните сигнали и задейства както апоптоза, така и автофагия. Изследователите съобщават, че метиленовото синьо намалява клетъчната смърт по дозозависим начин и че тази защита е съпроводена от признаци на макроавтофагия.

Последователността от маркерни промени е конкретна. Дифузното оцветяване за LC3B се преразпределя в перинуклеарни точковидни структури, започвайки около 20 nM метиленово синьо, като най-силният отговор на LC3-I и LC3-II е близо до 1 μM. Както LC3B-I, така и LC3B-II се повишават в зависимост от дозата и времето. Важно е, че екипът прави още една стъпка отвъд статичния имуноблот за LC3. Изследователите добавят 10 μM хлорохин, който блокира лизозомното разграждане, и установяват по-високи нива на LC3-II и стабилизиран p62 в клетките, третирани с метиленово синьо. Този модел подкрепя лизозомно зависим оборот, а не просто натрупване. Те показват също, че хлорохинът частично отменя антиапоптотичния ефект, което свързва защитата с автофагично-лизозомния път в този модел.

Резултатът за сигнализацията е частта, която най-често се цитира неправилно. Сигнализацията чрез AMPK, оценена по фосфорилираната AMPK и нейната мишена надолу по сигналния път — фосфорилираната ACC, се повишава на 12 и 24 часа по дозозависим начин. Инхибиторът на AMPK Compound C, приложен при 20 μM през последните 4 часа, намалява както фосфорилирането на ACC, така и активирането на LC3. За разлика от тях фосфорилираният mTOR не показва откриваемо потискане. Следователно в хипокампални клетки под стрес е установено индуциране, свързано с AMPK, по привидно независим от mTOR път. Същият модел се наблюдава при живи мишки, при които третирането с метиленово синьо индуцира маркери на макроавтофагия в кората и хипокампа.

Индуцирането не означава завършен автофагичен поток

Тук разграничението между понятията е най-важно. Индуцирането означава, че механизмите в началото на пътя образуват повече автофагозоми. Потокът означава, че съдържанието преминава през целия път: изолиране, узряване, сливане с лизозома, разграждане, рециклиране. Всяко повишение на LC3-II остава твърдение за индуциране, докато тест за автофагичен поток не потвърди останалата част от пътя.

Стандартният тест за автофагичен поток измерва LC3-II със и без краткотрайна лизозомна блокада, например с бафиломицин A1 или хлорохин. Ако третирането действително ускорява образуването, блокирането на разграждането би трябвало да повиши LC3-II още повече. Тандемният репортер mCherry-GFP-LC3 добавя втора гледна точка: структурите светят в жълто преди сливането с лизозома и само в червено, след като киселата среда потисне сигнала на GFP. Затова повече изцяло червени точковидни структури подкрепят напредването към кисели автолизозоми. Намаляването на белтъка p62 може да потвърди оборота на съдържанието, с уговорката, че самата транскрипция на p62 реагира на стрес и трябва да се проверява на ниво иРНК.

Контролният списък по-долу свързва всеки анализ, използван в тази литература, с това какво измерва и какво не може да докаже самостоятелно. Читателите могат да го използват при всяко бъдещо твърдение за макроавтофагия, включително аргументите за гладуване и дълголетие, които се позовават на тези маркери.

Обърнете внимание на една подвеждаща формулировка, от която таблицата предпазва. Фосфорилираната ACC е формата с потисната ензимна активност. Повишението ѝ показва сигнален отговор на AMPK, а не активиране на ACC.

Изразът „инхибирането на макроавтофагията премахва неврозащитата“ изисква същата точност. В модела HT22 той означава, че намесата в автофагично-лизозомния път премахва предимството за оцеляване, осигурено от метиленовото синьо при лишаване от серум. Това подкрепя ролята на автофагията като необходим или допринасящ фактор в тази клетъчна култура. То не установява автофагията като единствения защитен механизъм на съединението и не доказва, че хлорохинът действа изключително чрез автофагията. За укрепване на твърдението за причинност би била необходима генетична намеса в ATG5, ATG7 или ULK1.

Два пътя към един и същ механизъм

Една опростена схема помага. Енергийният стрес повишава активността на AMPK, AMPK активира комплекса ULK1 и автофагията започва. Растежните фактори и хранителните вещества повишават активността на mTORC1, mTORC1 инхибира ULK1 и автофагията остава изключена. Надолу по пътя след ULK1 комплексът от Beclin-1 и VPS34 инициира образуването на фагофора, LC3-I се липидира до LC3-II, автофагозомата се затваря, слива се с лизозомата и съдържанието се разгражда, като p62 също преминава през оборот.

Схемата поставя всеки резултат за метиленовото синьо на съответното място: резултата от хипокампалните клетки до разклонението AMPK, а резултата от прогениторните клетки до разклонението mTOR.

Тази рамка разрешава привидното несъответствие с второто изследване на Xie. При пролифериращи неврални прогениторни клетки от плъх отделен експеримент установява, че 5 μM метиленово синьо инхибира пролиферацията и насърчава преминаването в състояние на покой, като Ki67-положителните клетки намаляват на дни 1 и 3, докато вече започналата диференциация към неврони остава незасегната. Там механизмът преминава през потисната сигнализация чрез mTOR: намалени общ mTOR и фосфорилиран mTOR, заедно с по-ниска експресия на p70S6K и 4EBP1, както и понижена експресия на циклините E1, B1, D1 и D2. Доминиращият фенотип е покой на прогениторните клетки, който авторите свързват със забавена клетъчна сенесценция, а не със спасяване на хипокампални клетки под стрес.

Между двете публикации няма противоречие. AMPK и mTOR са зависими от контекста интегратори, а не неизменни превключватели. Клетка с невроноподобни характеристики под стрес може да задейства AMPK без измеримо инхибиране на mTOR, докато прогениторна клетка, стимулирана от митогени, може да отговори на същото съединение чрез ограничаване на mTOR-зависимите механизми за растеж. Типът клетка, контекстът на стреса, концентрацията и времевата точка определят кое разклонение доминира. Именно затова ефектите на метиленовото синьо върху митохондриалната енергетика и окислително-редукционните процеси са част от същата картина: както описва обзор на механизмите на неврозащита, съединението действа като алтернативен преносител на електрони, задейства антиоксидантна и антиапоптотична сигнализация, инхибира MAO и NOS и се свързва с митохондриалното обновяване чрез биогенеза и автофагия. Автофагията е едно разклонение от плейотропния профил, а не цялата картина.

Какво не показват експериментите

Лишаването от серум моделира трофичен и метаболитен стрес в клетъчна култура. То не моделира гладуване на целия организъм: глюкозата, аминокиселините и солите остават в основната хранителна среда и няма хранително поведение. Концентрациите в културата от 20 nM до 5 μM не могат да се преобразуват аритметично в дози за хора, защото абсорбцията, свързването с белтъци, окислително-редукционното състояние, метаболизмът, натрупването в тъканите и времето на излагане се различават.

Няма изпитване при хора, проектирано да демонстрира индуциран от метиленово синьо автофагичен поток при пациенти. Доказателствата за механизмите остават ограничени до клетъчни, ex vivo и животински изследвания, а обзорите все още описват данните за приложимост при хора като предварителни. Следователно тези изследвания не показват, че метиленовото синьо възпроизвежда гладуването, удължава човешкия живот чрез автофагия или осигурява завършен автофагичен поток в човешкия мозък. Твърденията за имитиране на гладуване и за дълголетие се нуждаят от собствени клинични доказателства, а изпитванията на метиленово синьо при хора за други показания не се превръщат в изпитвания на автофагията само по асоциация. Изследванията върху модели на стрес поради недостиг на хранителни вещества и на дълголетие трябва да се четат с това разграничение.

При следващата публикация, която прочетете, приложете контролния списък по ред. Първо попитайте кое разклонение се е променило: AMPK, mTOR или нито едно. След това попитайте дали резултатът за LC3 е съчетан с тест за автофагичен поток, или е самостоятелен. После проверете дали блокирането на пътя е премахнало ползата и по какъв метод. Изследване, което отговаря и на трите въпроса, дава основание за силно твърдение относно механизма. Изследване, което отговаря само на първия, е показало разрешаващ сигнал, а останалата част от пътя остава неизяснена.