Метиленовото синьо и поддържащите клетки в мозъка: астроцити, микроглия и възпаление

Да предположим, че провеждате два експеримента с едно и също синьо багрило и получавате два обнадеждаващи резултата. В единия съд звездовидни поддържащи клетки оцеляват при липса на кислород и глюкоза. В другия имунни клетки на мозъка запазват спокойната си разклонена форма въпреки наличието на бактериален токсин. Изкушаващо е двата резултата да се обединят в едно твърдение: багрилото успокоява възпалението в мозъка и го защитава. Именно при това обединяване внимателният читател трябва да спре и да се замисли.

Мозъкът има две популации поддържащи клетки с различни задачи и метиленовото синьо се изследва при всяка от тях чрез различен експериментален стимул. Астроцитите са клетки, които осигуряват метаболитна подкрепа. Те са разположени между кръвоносните съдове и невроните, отстраняват излишния глутамат, регулират нивата на калий, складират гликоген и доставят енергийни субстрати на невроните при рязко нарастване на потребностите. Микроглиалните клетки са местните имунни наблюдатели. Техните фини израстъци обследват тъканта, разпознават сигнали за бактерии и увреждане и при тревога се прибират, като клетките придобиват закръглена амебоидна форма, пригодена за миграция и поглъщане, и отделят сигнални молекули. Резултатът при едната популация не се пренася върху другата, а използваното във всеки случай измерване определя какво действително е показано.

Астроцити при метаболитен стрес: моментът на прилагане е ключовият резултат

Експериментът с астроцити започва с лишаване от необходимите ресурси. Изследователите култивират кортикални астроцити от новородени мишки, отстраняват глюкозата и почти целия кислород за шест часа, след което възстановяват и двете за двадесет и четири часа — лабораторен модел на инсулт, последван от реперфузия. Когато метиленовото синьо присъства по време на фазата на лишаване, клетъчната преживяемост се влошава. Когато се добавя само по време на фазата на реоксигенация, при 0.1 и 1 микромолар, преживяемостта се подобрява значително според тест за жизнеспособност с калцеин. Изследването върху миши астроцити представя тази разлика според момента на прилагане заедно с данните за клетъчното дишане.

Тази разлика е най-важният резултат. По време на лишаването почти няма кислород, който да приема електрони, така че системата за пренос на електрони няма къде да ги достави. При реоксигенацията клетъчният механизъм се задейства отново и багрилото вече има какво да прави. Третираните астроцити консумират повече кислород, усвояват повече глюкоза, произвеждат повече ATP и възстановяват запасите си от гликоген, при по-висока хексокиназна активност и без повишаване на митохондриалния супероксид. Предложеното обяснение е познатото от описанието на метиленовото синьо като митохондриален преносител на електрони: то пренася електрони покрай блокираните участъци в дихателната верига, така че дишането да се възобнови без изтичане на електрони, водещо до образуване на реактивни видове.

Обърнете внимание какъв тип доказателства са това. Става дума за резултат за преживяемостта и метаболизма на един изолиран клетъчен тип, с определен ефективен времеви прозорец — възстановяването, а не лишаването — и определен концентрационен диапазон. Той не казва нищо за имунната сигнализация и нищо за поведението.

Микроглия при бактериална тревога: препрограмиране на метаболизма

Експериментите с микроглия започват с противоположния стимул — не гладуване, а фалшив сигнал за инфекция. Липополизахаридът, фрагмент от външната мембрана на бактерии, се свързва със сензори на вродения имунитет и кара микроглията да реагира така, сякаш са се появили патогени, въпреки че няма живи бактерии. При мишки, получили липополизахарид, и в култивирана микроглиална клетъчна линия резултатът е познат възпалителен отговор: провъзпалителните фактори се повишават, микроглията се поляризира към агресивното състояние M1, съседните неврони загиват, а животните се справят по-зле със задачи за учене и памет.

Изследването на този отговор при мишки го проследява до сигнален път, който отчита кислорода: липополизахаридът предизвиква свръхекспресия на PHD3, един от трите ензима пролилхидроксилази, чрез разположената по-нагоре в сигналния път верига Siah2/Morg1. Същевременно клетките пренасочват енергийния си метаболизъм към аеробна гликолиза с повишени нива на митохондриални реактивни кислородни видове — промяна, която авторите измерват директно с метаболитни анализи Seahorse на консумацията на кислород и извънклетъчното подкиселяване. Метиленовото синьо обръща както метаболитната промяна, така и свръхекспресията на PHD3, понижава възпалителните фактори, намалява невроналната смърт и подобрява резултатите от поведенческите тестове. Позитронно-емисионната томография добавя образни данни: липополизахаридът повишава усвояването на глюкоза в хипокампа при FDG-PET, а третирането го понижава обратно, което съответства на по-слабо изразен възпалителен метаболизъм в живия мозък.

Това е по-богат набор от измервания в сравнение с изследването на астроцитите — цитокини, метаболизъм, образна диагностика и поведение при животни — но се отнася до различен стимул и различна клетка. Читателите, които сравняват двете изследвания, трябва да разграничават стимулите: едното спасява гладуващи поддържащи клетки по време на възстановяване, а другото потиска фалшив сигнал за инфекция в имунни клетки.

Микроглия под микроскоп: формата като показател

Трети експеримент разглежда същата бактериална тревога единствено чрез клетъчната форма. В глиални култури от кората на мозъка на плъхове контролните микроглиални клетки, оцветени за маркера IBA1, показват множество фини израстъци — разклонената форма, характерна за наблюдението на тъканта. След двадесет и четири часа излагане на липополизахарид при 10 микрограма на милилитър клетките се сплескват в амебоидна форма, а площта на клетъчното им тяло нараства, докато периметърът остава приблизително постоянен — геометричен признак на закръгляне. Метиленовото синьо при 1 микромолар, приложено едновременно с токсина, запазва разклонените израстъци и поддържа площта и периметъра на клетъчното тяло близо до контролните стойности. Изследването с клетъчни култури от плъхове количествено оценява това запазване на формата чрез измервания на площта и периметъра на клетъчното тяло.

Две подробности придават на това изследване по-голяма стойност от обикновено изображение. Първо, използваното за сравнение съединение менадион — друга редокс-активна молекула в същата концентрация — не запазва формата и само по себе си насочва клетките към активираната форма. Следователно ефектът не е общо свойство на всички молекули, участващи в редокс цикли. Второ, авторите свързват ефекта на багрилото с активиране на Nrf2 — транскрипционен фактор, който управлява програма за антиоксидантни и противовъзпалителни гени — а не само с пряко обезвреждане на реактивни видове. Свързаните материали за редокс и възпалителната сигнализация поставят тази връзка с Nrf2 в контекст.

Въпреки това формата е най-ограниченият от трите показателя. Разклонената клетка обикновено наблюдава тъканта, а закръглената обикновено е активирана, но морфологията е косвен показател, а не транскрипционен профил. Тази култура не съдържа имунни клетки, дошли чрез кръвта, невронни вериги или измерим поведенчески отговор.

Съпоставка на трите резултата

Общото между редовете е, че всеки стимул има свое измерване и свой отговор. Метаболитното спасяване отговаря на въпрос за метаболизма. Данните за цитокини и поведение отговарят на въпрос за възпалението. Формата отговаря на въпрос за формата. Нито един от трите резултата сам по себе си не може да се пренесе в друга област.

Какво не доказва по-спокойно изглеждащата микроглия

Цялата тема се нуждае от това изречение: микроглия, която изглежда по-слабо активирана, или променен микроглиален метаболизъм сами по себе си не доказват подобрена мозъчна функция.

Морфологията може да се промени, без да последва промяна във функцията. Една клетка може да запази разклоненията си и все пак да отделя цитокини, или да се закръгли, докато извършва полезно отстраняване на клетъчни остатъци. Метаболитните измервания имат същото ограничение: крива от Seahorse или PET сканиране показва енергийния метаболизъм, а не познавателните способности. Изследването при мишки, което съчетава метаболитни и морфологични показатели с поведенчески тестове, е по-силно именно защото обединява различни нива на доказателства, вместо да оставя заключението да се опира на едно измерване. Дори там важат обичайните ограничения: липополизахаридът моделира стерилен сигнал за тревога, а не реална инфекция, мишките не са хора, а самите автори подчертават различията между видовете. Всеки, който планира последваща работа, трябва да прецени доколко резултатите за микроглията се пренасят между моделите, преди да приеме, че сигналният път се държи по същия начин в човешка тъкан.

Оттук следва практичен извод за момента на прилагане. При астроцитите ранното прилагане води до по-лош резултат, а прилагането по време на възстановяване — до по-добър. Резултатите при микроглията идват от прилагане около момента на възпалителния стимул. Мозъчното увреждане в реални условия съчетава двете фази едновременно: енергиен срив и имунна тревога, които се развиват в продължение на часове. Експеримент, който изолира една фаза, не може да определи графика за комбинирания случай. Затова при обсъждането на времевите прозорци за прилагане хронологиите на лишаването и възпалението се разглеждат отделно.

Коректното обобщение се побира в един абзац. При изолирани астроцити метиленовото синьо, приложено по време на реоксигенация, възобновява дишането и спасява клетките. При микроглия, изложена на бактериален фрагмент, то обръща възпалителна метаболитна програма чрез специфичен сигнален път на PHD3 и запазва формата в покой. Всеки резултат е реален в рамките на съответната експериментална постановка, но нито един не е обща оценка за възпалението в мозъка. Съпоставката на глиалните клетки е полезна именно защото не позволява двете истории да се слеят в една.