Метиленовото синьо като анаеробен и кислороден индикатор: какво доказва промяната на цвета

Лаборантка затваря херметично анаеробен съд, проверява индикаторната лента с метиленово синьо през капака и вижда това, което иска да види. Лентата е променила цвета си от син на бял. Тя записва, че опитът е проведен при анаеробни условия, и продължава нататък. Два дни по-късно в една петри не се наблюдава растеж, а запечатана епруветка с бульон в същия съд показва признаци на излагане на кислород. Лентата е показала истината. Лаборантката ѝ е задала грешния въпрос.

Объркването е концептуално. Анаеробният индикатор с метиленово синьо се основава на редокс процеси, а не на стерилност и не на валидиране на цялата система. Щом това разграничение стане ясно, лентата се превръща в точен и надежден инструмент с тясно определена задача.

Принципът: обратима редокс двойка

Разтвореното метиленово синьо съществува в две състояния. Окислената форма е познатият син катион. Редуцираната форма, наречена левкометиленово синьо, е безцветна. При pH, близко до неутралното, опростената полуреакция представлява един син катион плюс един протон плюс два електрона, които образуват една безцветна левко молекула. Формалният потенциал е близо до плюс 11 миливолта спрямо стандартния водороден електрод при pH 7. Това го поставя в диапазон, който много редуциращи системи могат да достигнат и в който кислородът може да обърне реакцията.

Редукцията изисква нисък локален редокс потенциал. Самото отстраняване на кислорода невинаги е достатъчно. Ранни изследвания на анаеробиозата установяват, че метиленовото синьо в чиста вода без кислород запазва цвета си, ако няма редуциращо вещество. Смеси от декстрозен бульон с около 0.01 процента багрило се обезцветяват лесно при 37 C, докато същата смес, държана при 4 C, остава синя в продължение на един ден, както е описано в експерименти с прясна тъкан и анаеробни условия за култивиране. Температурата, pH, глюкозата, аскорбатът, тиогликолатът и редуциращата активност на микроорганизмите определят дали електроните са достъпни.

За повторното окисление е необходим само кислород. Когато въздухът достигне левко формата, тя отново се превръща в синята форма. Съвременните разработени индикатори използват точно този цикъл: багрило плюс редуциращ агент плюс стабилизираща матрица, безцветни при ниско съдържание на кислород и отново сини при излагане на въздух. Това е демонстрирано при хибриден кислороден индикатор с метиленово синьо, базиран на багрило, редуциращ агент, повърхностноактивно вещество и глина. Този прототип използва 0.01 милимоларно багрило с 2.0 милимоларен аскорбат или глюкоза при pH 11, обезцветява се при около 0.5 обемни процента кислород и различава съдържание под 0.1 процента от съдържание над 0.5 процента кислород в изпитвателната си камера.

Следователно принципът на действие е прост. Синият цвят означава, че индикаторната зона е окислена. Безцветното състояние означава, че в индикаторната зона са достигнати редуциращи условия с ниско съдържание на кислород. Промяната е обратима, локална и химична. Сама по себе си тя не казва нищо за микроорганизмите.

Как работи индикаторната лента с метиленово синьо в анаеробен съд

Индикаторната лента с метиленово синьо за анаеробен съд представлява малка реакционна зона, поставена в атмосферата на съда така, че да може да се наблюдава, без той да се отваря. Предлаганите търговски форми се различават: хартиени ленти, таблетки, които се разтварят или навлажняват при подготовката, и по-нови хибридни хартии. Някои изискват една капка дестилирана вода за активиране на реакционната зона. Други са устройства в сух формат, които трябва да останат сухи. Определяща е инструкцията за конкретния продукт, защото овлажняването, разположението и времето за отчитане са част от химичния процес.

На практика предвиденото отчитане е двоично. Синият цвят означава, че при лентата все още има кислород или недостатъчно редуциращи условия. Белият цвят или безцветното състояние означава, че при лентата са установени анаеробни редокс условия. Някои търговски индикаторни хартии съдържат червен фонов пигмент, така че крайното им редуцирано състояние се отчита като розово, а не бяло. Преди да оценявате резултата, трябва да знаете какъв краен цвят е предвиден за вашия продукт.

Времето варира според системата. В една постановка от типа GasPak избледняването започва в рамките на около един час и завършва в рамките на няколко часа, докато при контролирано сравнение при стайна температура метиленовото синьо се нуждае от повече от шест часа. В това изследване редокс потенциалът на хранителните среди достига приблизително минус 100 миливолта в рамките на 60 до 100 минути, доста преди багрилото да приключи промяната си, и е значително под минус 200 миливолта, когато лентата стане напълно безцветна. Индикаторът реагира със закъснение спрямо промяната в атмосферата. Синя лента на първия час не доказва неуспех, а бяла лента на шестия час описва състоянието при лентата на шестия час.

Разположението е важно по същата причина. Дръжте лентата в газовото пространство над пробите, видима през капака, далеч от агарни повърхности и хранителни среди. Тя отчита непосредственото си обкръжение. Ако я поставите плътно до студена стена, затрупате я с петри или позволите да се напои с кондензат, тя ще отчита тази микросреда, а не средата в съда.

Какво показва лентата и какво не показва

Разглеждайте индикатора с метиленово синьо в анаеробния съд като един сензор на едно място. Той установява локалните редокс и кислородни условия в собствената си реакционна зона, които са общо взето представителни за газовото пространство, ако смесването и уравновесяването са достатъчни. Всичко отвъд това е извод, а изводът изисква отделни доказателства.

Безцветната лента не установява стерилност. Стерилността е отсъствие на жизнеспособни организми, доказано чрез валидирана стерилизация и контролни проби за валидиране при култивиране. Един съд може да е напълно анаеробен и все пак замърсен, или напълно стерилен и все пак аеробен.

Тя не валидира всяка част от системата за култивиране. Разтвореният кислород в запечатана епруветка, кислородът, задържан в дълбоки агарни слоеве, градиентите в претоварен съд и течът, който се появява след отчитането, остават извън обхвата на една лента. Експерименти с пространственото разпределение показват съседни сини и безцветни зони в един и същ съд, където проникването на кислород и редуциращата активност се уравновесяват по различен начин. Една точка не може да удостовери условията в цял обем.

Тя не доказва непрекъсната анаеробиоза. Лента, отчетена веднъж при подготовката, не казва нищо за двадесетия час. Скорошни изследвания на качеството на анаеробните условия предупреждават, че химичните индикатори описват атмосферата в момента на отчитането и могат да изглеждат задоволително въпреки наличието на малко количество остатъчен кислород. Непрекъснатото документиране или документирането в контролни моменти, а не един поглед към крайното състояние, свързва показанието на лентата с инкубацията.

За химичните процеси зад промяната на цвета вижте как метиленовото синьо преминава между окислено и редуцирано състояние. За по-общото влияние на кислорода върху работата с проби вижте контрола на кислорода при микроскопия и култивиране.

Схема, която да държите до съда

Фигурата по-долу обобщава статията в един справочник за лабораторната маса. Три състояния на една и съща лента, двете посоки на реакцията и границата между данните от индикатора и валидирането на системата.

Причини за неизправност, които оставят лентата синя или създават фалшиво спокойствие

Повечето неизправности попадат в пет групи. Всяка има характерни признаци.

Неуплътнен съд или плик продължава да пропуска кислород към реакционната зона. Лентата остава синя или отново посинява след избледняване. Проверете капака, уплътнението, скобите и уплътняващите повърхности, преди да търсите причината в химичния процес.

Изчерпан или неправилно активиран газогенератор изобщо не отстранява кислорода. При по-старите системи, активирани с вода, липсата на кондензация около 10 до 15 минути и липсата на затопляне на капака около 20 до 40 минути са ранни предупредителни признаци за съответната система. Саше с недостатъчен капацитет в претоварен съд води до същия проблем.

Отравянето на катализатора се отнася само за по-старите системи с водород и паладий, при които паладият катализира свързването на водорода и кислорода във вода. Влагата и сероводородът влошават действието му. Много съвременни сашета изобщо не използват паладий, затова не прилагайте това решение там, където то не е уместно.

Лента с влошени свойства или използвана неправилно може да откаже без явни признаци. Багрилото и редуциращият агент губят обратимостта си при съхранение. Това е една от причините да бъдат разработени хибридни формулировки, устойчиви на избледняване под въздействието на светлината и на загуба на свойства при съхранение. Не използвайте ленти с изтекъл срок на годност, с необичаен начален цвят, както и ленти, навлажнени, когато трябва да са сухи, или оставени сухи, когато изискват навлажняване.

Градиентът или забавената реакция подвеждат наблюдателя, а не химичния процес. Недостатъчно смесеното газово пространство, запечатаните епруветки с разтворен кислород и полутвърдите среди запазват собствените си условия по-дълго, отколкото подсказва лентата. Лентите с резазурин преминават през розово към безцветно състояние и често се предлагат като по-бързи, но праговете им са специфични за тяхната формулировка и не могат да се пренасят към метиленовото синьо.

Контроли и протокол за отчитане, които си струва да възприемете

Две евтини контроли откриват повечето погрешни интерпретации. Дръжте нова контролна лента в стайния въздух успоредно с провеждането на опита. Работещата лента с метиленово синьо остава синя там. Някои опаковани индикатори първоначално са бледи и посиняват при отваряне, което само по себе си е функционална проверка. Освен това периодично поставяйте нова лента в предварително валидирана анаеробна постановка. Тя трябва да достигне валидираното крайно редуцирано състояние в рамките на посоченото за продукта време. Ако някоя от контролите не се държи според очакванията, заменете партидата, преди да се доверите на показанията в съда.

Протоколът за отчитане следва от механизма. Поставете лентата в газовото пространство на място, където се вижда, без да отваряте съда, като следвате инструкцията за продукта относно контакта със стените и навлажняването. Запишете началния цвят, часа на херметичното затваряне на съда и цвета в посочения за продукта контролен момент. Когато съдът позволява, документирайте, че индикаторът е останал редуциран в определени контролни моменти по време на инкубацията. Запишете крайния цвят непосредствено преди отваряне. Този цвят преди отварянето е крайният резултат за съответния опит. След отваряне очаквайте повторно посиняване и не позволявайте то да променя вече отчетения резултат.

Ако лентата остане синя след посоченото време, приемете анаеробиозата за непотвърдена. Проверете последователно: уплътняването, сашето, катализатора, ако има такъв, овлажняването и срока на годност на индикатора, а след това работата му спрямо контролата във въздух. Едва след като атмосферата бъде потвърдена, трябва да се интерпретира наличието или липсата на растеж, като се използват постановка за анаеробно култивиране и контроли с организми, съобразени с приложението.

В собствената си област лентата заслужава последната дума. Синя или безцветна, тя отговаря на един въпрос за едно място в един момент. Задавайте ѝ този въпрос по график, с контроли до нея, и тя ще отговаря надеждно. Питайте я за стерилността, за всяка епруветка или за цялата инкубация въз основа на един поглед и никоя индикаторна химия няма да спаси интерпретацията.