Алкалното метиленово синьо на Льофлер и полихромното метиленово синьо: обяснение

На работната маса за оцветяване могат да стоят три бутилки една до друга, всяка с етикет за някаква разновидност на метиленовото синьо. На едната пише водно метиленово синьо 1%. На другата — алкално метиленово синьо на Льофлер. На третата — полихромно метиленово синьо. Заетият лаборант посяга към най-близката. След това натривката се оцветява твърде слабо, твърде равномерно в синьо или в неочаквани виолетови нюанси, а вината за резултата се приписва на пробата.

Проблемът е в състава на разтвора, а не в пробата. Трите разтвора съдържат сродни багрила, но се основават на различни принципи на оцветяване. Единият е обикновено катионно багрило при почти неутрално pH. Другият е същото багрило, чието действие е усилено с алкали. Третият вече изобщо не е единично багрило, а целенасочено окислена смес. Ако използвате неподходящия разтвор, самият принцип на оцветяване се променя в хода на работата ви.

Краткият отговор

Обикновеното водно метиленово синьо е отправната точка: около 1% багрило във вода, просто катионно багрило за бактериална морфология и обща микроскопия. При алкалното метиленово синьо на Льофлер към изходен спиртен разтвор, разреден с вода, се добавя малко, точно отмерено количество разреден алкален разтвор. Това повишава pH и засилва свързването на катионното багрило с киселинните бактериални структури. Полихромното метиленово синьо е метиленово синьо, подложено на целенасочено „узряване“ чрез окисление в алкална среда. Затова бутилката съдържа смес от деметилирани хомолози (azure A, azure B, azure C), тионин и метиленово виолетово наред с остатъчно метиленово синьо, а тази смес оцветява различните структури в различни нюанси.

Ако запомните само едно изречение: алкализирането променя интензивността на оцветяването, а полихромирането променя цветовете.

Обикновено водно метиленово синьо: отправната точка

Най-простият състав е метиленово синьо, разтворено във вода, обикновено при 1% w/v, без алкали и без окисление. Оцветената химична частица е метилтиониниевият катион с хлориден противойон — малко, плоско фенотиазиново багрило, описано в записа за метиленово синьо в PubChem като метилтиониниев хлорид. Като катион то се свързва с фосфатния скелет на нуклеиновите киселини и с киселинните групи по бактериалните клетъчни стени, като оцветява клетките в синьо на светъл фон.

Неговото предимство е предвидимостта. Ядрата и бактериите изглеждат сини. Контрастът е умерен. Слабо видимите микроорганизми може да се оцветят недостатъчно — именно това ограничение Льофлер се е заел да преодолее. За по-широката група прости бактериални оцветявания, към която принадлежи този разтвор, вижте обзор на простото оцветяване на бактерии. И тук точната идентификация е важна: метиловото синьо е съвсем различна молекула, както е обяснено в метилово синьо спрямо метиленово синьо, така че търсенето в каталог само по име на цвят може да доведе до погрешния клас багрила.

Алкално метиленово синьо на Льофлер: същото багрило с усилено действие

Класическата рецепта на Льофлер съчетава изходен спиртен разтвор на метиленово синьо с разреден алкален разтвор във вода. Вариантите в учебниците предвиждат 0.3 g багрило в 30 mL 95% етанол плюс 100 mL 0.01% воден разтвор на калиев хидроксид (или еквивалентно 30 mL наситен спиртен разтвор на метиленово синьо, 100 mL дестилирана вода и 1 mL 1% KOH), което дава работен разтвор с около 0.3% багрило и отчетливо алкално pH. Търговските варианти следват същия принцип, а каталогът на Thermo Fisher за микробиологични багрила посочва алкалното метиленово синьо на Льофлер наред с полихромния и водния вариант като отделни каталожни продукти с различни предназначения.

Ключът е в алкализирането. Повишаването на pH депротонира карбоксилните и фосфатните групи в препарата, като увеличава плътността на отрицателно заредените участъци. Същевременно изходният етанолов разтвор поддържа багрилото напълно разтворено, така че то достига до тези участъци в мономерна форма. Резултатът е по-бързо и по-интензивно оцветяване на бактериите, отколкото с неутралното водно багрило, с познатите наситено сини пръчици и коки в рутинната бактериологична натривка. Оцветяването обикновено трае от една до три минути, след което се изплаква с вода.

Класическото приложение е Corynebacterium diphtheriae, отгледана върху серумна среда на Льофлер: тънки, често бухалковидни пръчици със силно оцветени метахроматични гранули на Бабеш–Ернст, съдържащи запасен полифосфат. Съчетаването на средата и багрилото е историческо — и двете се приписват на един и същ бактериолог, а контрастът на гранулите е диагностичното предимство. Извън работата с дифтерия багрилото се използва за общо бактериологично оцветяване на натривки от култури, за морфологията на Neisseria в клинични натривки и навсякъде, където оцветяване по Грам не е необходимо, но обикновеното водно метиленово синьо дава твърде слабо оцветяване. Това е монохромно багрило. Всички киселинни структури придобиват някакъв нюанс на синьото. Когато протоколът изисква диференциране по цвят, само алкализирането не може да го осигури.

Едно практическо предупреждение: алкалните разтвори на багрилото се влошават и образуват утайка при съхранение и поглъщане на въглероден диоксид. Лабораториите или приготвят малки обеми, или купуват каталожния разтвор и спазват срока му на годност, вместо да продължават да използват стара бутилка, която вече оставя утайка върху всяко предметно стъкло.

Полихромно метиленово синьо: едно име, няколко багрила

Полихромното метиленово синьо се получава от същото багрило, но чрез контролирано окисление в алкална среда, исторически наричано „узряване“ или полихромиране. Стареенето в алкална среда, нагряването с карбонат или окислението с реагенти като дихромат поетапно отстраняват метилови групи от диметиламиновите заместители. Продуктът е смес: остатъчно метиленово синьо плюс azure B (с една отстранена метилова група), azure A и azure C (с допълнително деметилиране), тионин (напълно деметилиран) и странични продукти на окислението от групата на метиленовото виолетово. Всеки компонент има собствен нюанс и афинитет към тъканите, затова сместа оцветява метахроматично: ядрата, гранулите, муцините и хрущялът придобиват различни тонове от синьо до червено-виолетово.

Това е същата химия, която стои зад известните оцветявания на кръвни препарати. Първите изследователи установили, че алкализираното метиленово синьо оцветява ядрата на маларийните паразити във виолетови нюанси, но техните водни „узрели“ разтвори били нестабилни и образували утайка в рамките на дни. Обзорът за създаването на виолетовото оцветяване на кръвни препарати проследява как Малаховски и Романовски независимо използвали този ефект през 1891, как бил въведен метанолът за стабилизиране на утайката от багрило и фиксиране на натривките без нагряване и как по-късно Гимза стандартизирал сместа чрез точно отмерени количества azure B и еозин със стабилизиране с глицерол. Съвременните багрила от типа на Гимза произлизат пряко от полихромното метиленово синьо плюс еозин — съчетанието, което създава ефекта на Романовски. За подробности относно съчетаването с еозин и компонента azure B вижте багрила от типа на Романовски и взаимодействието между azure B и еозин.

Тъй като представлява смес, полихромното метиленово синьо по природа е най-слабо стандартизираното от трите. Точният баланс на нюансите му зависи от начина и степента на окисление. Затова доставчиците за хистология го продават като отделен продукт със собствени изпитвания на оцветителните свойства, а не като състарен разтвор на Льофлер. Типичните приложения включват метахроматично визуализиране на гранули на мастоцити, муцини и хрущял, детайли на плазматични клетки и Helicobacter pylori в тъканни срезове чрез полихромни методи от типа на Гудпасчър. То е правилният избор, когато целта е диференциране по цвят, и погрешният избор, когато протоколът изисква ясен монохромен контур на бактериите.

Сравнение на състава и предназначението

Използвайте таблицата като алгоритъм за избор. Ако препаратът се оцветява твърде слабо, променете подхода към pH и посегнете към разтвора на Льофлер. Ако всичко се оцветява, но нищо не се отличава, променете подхода към багрилото и посегнете към полихромното. Ако натривка, оцветена по Льофлер, показва гранулите отлично, но ръководителят пита защо ядрата и цитоплазмата са в един и същ син нюанс, отговорът е, че никое алкално монохромно багрило не може да изпълни тази задача. Тя е за полихромната група и нейните производни за оцветяване на кръвни препарати.

Как да избегнете обичайните обърквания

Две грешки обясняват повечето обърквания. Първата е разтворът на Льофлер да се приема за взаимозаменяем с обикновеното метиленово синьо, защото и двата изглеждат сини в бутилката. Те се различават по pH и интензивност, а замяната с неутрално багрило там, където е предписан разтворът на Льофлер, води до загуба именно на контраста на гранулите, на който се основава протоколът. Втората е всяко старо или случайно състарено алкално метиленово синьо да се приема за полихромно. Неконтролираното стареене създава неизвестна смес с неизвестна концентрация, докато истинските полихромни разтвори се приготвят по определени методи на окисление и, при производните за оцветяване на кръвни препарати, се съчетават с точно отмерен еозин. Историята тук е поучителна: нестабилните водни „узрели“ разтвори от 1890-те години отстъпили място на стабилизирани метанолови състави именно защото неконтролираните смеси не можели да бъдат възпроизведени. Добре е да си припомните този урок, преди да оцветите диагностичен препарат с разтвор от бутилка с неясна възраст.

Точното разграничаване на наименованията завършва проверката. Потвърдете каталожния продукт (водно, на Льофлер или полихромно), съдържанието на багрило и предназначението по етикета, вместо да ги извеждате от цвета. Трите състава имат общ хромофорен предшественик. Но нямат общо предназначение.