Артыкул
Тэст аднаўлення метыленавага сіняга ў малацэ: прынцып і абмежаванні
Студэнтка падымае дзве прабіркі з малаком. У адной малако пабялела за гадзіну. У другой яно заставалася сінім пяць гадзін. Яна паказвае на сінюю прабірку і кажа, што гэта малако бяспечна піць.
Такая выснова сведчыць пра няправільнае разуменне тэсту. Тэст малака з метыленавым сінім не вызначае бяспеку. Ён паказвае, як хутка мікраарганізмы ў гэтай прабірцы зніжаюць акісляльна-аднаўленчы патэнцыял пры фіксаваных умовах. Павольны вынік азначае нізкую сумарную метабалічную актыўнасць ва ўзоры. Ён нічога не кажа пра тое, якія арганізмы прысутнічаюць, ці ёсць сярод іх патаген і ці было малако правільна пастэрызавана.
Гэтае адрозненне важнае, бо тэст выглядае пераканаўча. Сіні колер знікае. Гадзіннік дае лік. Лікі падштурхоўваюць да празмерных высноў. Гэты артыкул захоўвае карысную інтэрпрэтацыю і адхіляе небяспечную.
Што насамрэч вымярае аднаўленне
Метыленавы сіні мае сіні колер у акісленай форме і амаль бясколерны пасля аднаўлення да лейкаметыленавага сіняга. Свежае малако змяшчае раствораны кісларод, які падтрымлівае сіні колер фарбавальніка. Бактэрыі, якія ажыццяўляюць дыханне і ферментацыю, спажываюць гэты кісларод і выдзяляюць аднаўляльныя злучэнні. Калі акісляльна-аднаўленчы патэнцыял падае дастаткова нізка, фарбавальнік прымае электроны і губляе колер. Навучальны тэкст па мікрабіялогіі малака Універсітэта Гуэлфа апісвае тую ж паслядоўнасць: выдаленне кіслароду, пасля якога ў ходзе бактэрыяльнага метабалізму ўтвараюцца аднаўляльныя рэчывы.
Класічнае даследаванне ў Journal of Dairy Science апісвае гэта як двухэтапны працэс: спачатку мікрафлора вычэрпвае кісларод, затым кампаненты малака хутка аднаўляюць фарбавальнік. Таму тэст аднаўлення метыленавага сіняга ў малацэ варта разумець як функцыянальную ацэнку сукупнай метабалічнай актыўнасці, а не як падлік клетак. Акісляльна-аднаўленчыя ўласцівасці метыленавага сіняга тлумачаць хімічную аснову гэтага пераходу.
Кісларод можа павярнуць змену колеру назад. Адноўленая лейкаформа фарбавальніка пры кантакце з паветрам зноў акісляецца і сінее. Таму ўстрэсванне, пераліванне, шырокія прабіркі і вялікая паветраная прастора над вадкасцю затрымліваюць вынік. Пасля абясколервання асноўнага аб’ёму ў прабірцы на паверхні, якая кантактуе з паветрам, часта захоўваецца тонкае сіняе кольца. Стандартныя працэдуры дапускаюць гэтае кольца і не патрабуюць чакаць яго знікнення.
Тып арганізмаў уносіць другое скажэнне. Каліформныя бактэрыі і многія малочнакіслыя мікраарганізмы хутка аднаўляюць фарбавальнік. Многія псіхратрофныя і тэрмаўстойлівыя арганізмы аднаўляюць яго павольна або амаль не аднаўляюць. У двух узорах малака з аднолькавай колькасцю калоній на пажыўным асяроддзі сіні колер можа знікнуць з розніцай у некалькі гадзін. Ужо адзін гэты факт выключае пералік часу ў колькасць калоній.
Кантраляваная лабараторная працэдура
Палявыя і навучальныя варыянты адрозніваюцца ў дэталях, таму вынік сапраўдны толькі ў межах метаду, якім ён атрыманы. Звычайны варыянт для харчовай лабараторыі выконваецца наступным чынам:
- Адбярыце сырое малако з мінімальнай аэрацыяй і неадкладна ахаладзіце яго. Перад адборам узору змяшайце малако асцярожным пераварочваннем ёмістасці.
- Унясіце 10 mL малака ў стэрыльную прабірку з 1 mL рабочага раствору фарбавальніка. Адна з шырока ўжываных рабочых канцэнтрацый фарбавальніка складае 0.005 працэнта, пры суадносінах малака і фарбавальніка 10 да 1.
- Закрыйце прабірку коркам, асцярожна перавярніце двойчы і на працягу некалькіх хвілін пастаўце ў вадзяную лазню. Звычайная тэмпература інкубацыі складае ад 35 да 38 градусаў Цэльсія ў залежнасці ад канкрэтнага стандарту. Запішыце, якім стандартам вы карыстаецеся.
- Падчас інкубацыі абараняйце прабіркі ад святла, бо святло паскарае аднаўленне.
- Праверце колер праз 30 хвілін, затым правярайце праз фіксаваныя інтэрвалы. Канчатковая кропка — гэта момант, калі колер змесціва прабіркі супадае з эталонам кіпячонага малака або дасягае ступені абясколервання, вызначанай працэдурай.
- Калі метад патрабуе візуальнага кантролю, пакіньце прабірку з тым жа малаком без апрацоўкі.
Дапаможнік FAO па даследаванні малака прыводзіць дакладны палявы варыянт гэтай паслядоўнасці: 10 mL малака плюс 1 mL фарбавальніка, закрыццё коркам, асцярожнае пераварочванне, інкубацыя пры тэмпературы каля 37–38 градусаў і праверка кожныя 30 хвілін. У кантрольных прабірках выкарыстоўваецца кіпячонае малако, каб разбурыць натуральную аднаўляльную сістэму і задаць эталон для параўнання колеру.
Схема вышэй акрэслівае ўмовы кантролю. Аднолькавыя аб’ёмы, аднолькавы фарбавальнік, аднолькавая тэмпература, аднолькавае змешванне, аднолькавая абарона ад святла, аднолькавае правіла вызначэння канчатковай кропкі. Змяніце любую з гэтых умоў — і час таксама зменіцца. Таму хатнія варыянты з адвольнай канцэнтрацыяй фарбавальніка нельга параўноўваць з лабараторнымі ацэнкамі.
Пра што сведчыць час аднаўлення
Даўжэйшы час азначае ніжэйшую сумарную актыўнасць пры зададзеных умовах. Карацейшы час азначае вышэйшую сумарную актыўнасць. Навучальныя табліцы па малочнай справе звязваюць гэтыя інтэрвалы часу з прыблізнымі ацэнкамі: напрыклад, у адной схеме, заснаванай на BIS, 5 або больш гадзін адпавядаюць вельмі добрай якасці, а менш за 30 хвілін — дрэннай.
Галоўнае тут — адрозненні паміж схемамі. Вынік у 5 гадзін не мае ўніверсальнай ацэнкі. Ён належыць да працэдуры, якая яго вызначыла. Таму абгрунтаваны фармат справаздачы такі:
MBRT складае X гадзін паводле названага метаду, што адпавядае ацэнцы ў межах гэтага метаду.
Гэта ніколі не азначае, што MBRT складае X калоніеўтваральных адзінак на mL. Рэкамендацыі, заснаваныя на Standard Methods, указваюць, што вынікі аднаўлення фарбавальніка нельга падаваць як колькасць бактэрый. Працэдура простага афарбоўвання метыленавым сінім таксама адказвае на іншае пытанне, бо паказвае форму клетак пад мікраскопам, а не сумарную актыўнасць у прабірцы.
Табліца інтэрпрэтацыі і абмежаванняў
Гэтая табліца — арыгінальны даведачны матэрыял да артыкула. Чытайце кожны радок цалкам. Ніводная ячэйка не мае самастойнага значэння.
| Назіранне або сцвярджэнне | Пра што яно сведчыць | Чаго яно не можа даказаць | Асноўныя фактары, якія скажаюць вынік |
|---|---|---|---|
| Хуткае знікненне сіняга колеру, менш чым за 2 гадзіны ў адной са схем для сырога малака | Высокая аднаўляльная актыўнасць, якая ўзгадняецца з вялікай мікробнай нагрузкай або нізкай устойлівасцю пры захоўванні | Відавы склад, дакладную колькасць, наяўнасць таксінаў або парушэнне пастэрызацыі | Захоўванне ў цяпле, мікрафлора з вялікай доляй каліформных бактэрый, святло, малая колькасць фарбавальніка |
| Прамежкавы час, ад 2 да 4 гадзін | Умераная актыўнасць; ацэнка магчымая толькі ў межах названай схемы | Бяспеку або адсутнасць арганізмаў, якія павольна аднаўляюць фарбавальнік | Высокая тэмпература інкубацыі, адрозненні ў аэрацыі, аддзяленне тлушчу |
| Павольнае аднаўленне, 5 або больш гадзін | Нізкая сумарная актыўнасць у межах гэтай схемы | Адсутнасць патагенаў, факт пастэрызацыі або хімічную бяспеку | Рэшткі антыбіётыкаў, кансерванты, дадатковы раствораны кісларод, вялікая колькасць фарбавальніка |
| Сіняе кольца захоўваецца на паверхні, а асноўны аб’ём абясколерваецца | Паўторнае акісленне на мяжы з паветрам, нармальны краявы эфект | Няўдалы тэст або няпоўную рэакцыю | Шырокая прабірка, няшчыльны корак, паўторнае адкрыванне для агляду |
| Белае змесціва прабіркі пасля інкубацыі нагрэтага малака | Змененая аднаўляльная сістэма разам з актыўнасцю мікраарганізмаў, якія выжылі | Што награванне адпавядала валідзіраванай пастэрызацыі | Цеплавое пашкоджанне, аднаўленне падчас інкубацыі, пазнейшае забруджванне |
| Любое асобнае значэнне MBRT, прыведзенае без метаду | Умовы тэсту невядомыя | Якую-небудзь ацэнку або колькасць | Не пазначаны склад фарбавальніка, суадносіны, тэмпература, змешванне і правіла вызначэння канчатковай кропкі |
Метады, заснаваныя на росце, напрыклад вырошчванне бактэрый на пажыўных асяроддзях, застаюцца спосабам падліку і выдзялення мікраарганізмаў. Прабірка з тэстам аднаўлення служыць для скрынінгу. Пасеў на асяроддзе — для ідэнтыфікацыі і падліку.
Чаго тэст не можа даказаць пра бяспеку
Павольны вынік не можа даказаць адсутнасць патагенаў. Патаген, прысутны ў клінічна значнай колькасці, можа мала ўплываць на сумарнае спажыванне кіслароду. Выяўленне патагенаў патрабуе метадаў, спецыфічных для пэўных арганізмаў; у актуальным выданні Standard Methods гэта разглядаецца асобна ад агульнага скрынінгу якасці.
Тэст не можа пацвердзіць пастэрызацыю. Паводле рэкамендацый Codex па гігіене малочнай прадукцыі, для праверкі цеплавой апрацоўкі выкарыстоўваюць тэст на шчолачную фасфатазу або іншы валідзіраваны метад. Белае або сіняе змесціва прабіркі нічога не кажа пра тэмпературу і працягласць апрацоўкі партыі.
Тэст не можа пацвердзіць харчовую бяспеку. Бяспека залежыць ад патагенаў, ужо ўтвораных таксінаў, рэшткаў лекавых сродкаў, хімічных забруджвальнікаў, гісторыі халадовага ланцуга і забруджвання пасля адбору ўзору. Codex разглядае бяспеку малочнай прадукцыі як ланцуг кантрольных мер, а не як адзін вынік скрынінгу.
Харчовая лабараторыя — не хатняе тэставанне
У малочнай лабараторыі тэст выкарыстоўваюць для скрынінгу малака пры прыёмцы, параўнання пастаўшчыкоў з цягам часу або навучання акісляльна-аднаўленчай мікрабіялогіі пад наглядам. Узоры можна прасачыць. Рэактывы стандартызаваныя. Тэмпературы рэгіструюцца. Адходы накіроўваюцца на лабараторную ўтылізацыю.
У хатнім тэставанні нічога гэтага няма. Кухонныя вымярэнні аб’ёму прыблізныя. Канцэнтрацыі фарбавальнікаў, якія прадаюцца ў інтэрнэце, моцна адрозніваюцца. Інкубацыя часта адбываецца ў цёплым пакоі, а не ў калібраванай вадзяной лазні. Колер усё роўна змяняецца, і таму вынік здаецца надзейным, хоць адсутнічаюць усе кантрольныя ўмовы, якія надавалі яму сэнс.
Большая небяспека звязаная з паводзінамі. Сіняя прабірка дома падштурхоўвае піць сырое малако, якое лабараторыя ўсё роўна накіравала б на падлік калоній, скрынінг патагенаў і праверку рэшткавых рэчываў. Тэст малака з метыленавым сінім быў распрацаваны для ацэнкі сырога малака пры прыёмцы, а не для пацвярджэння яго прыдатнасці да спажывання. Хутчэйшы скрынінг з рэзазурынам мае тое ж абмежаванне: вынік паводле колеру атрымліваецца хутчэй, але адказу пра патагены па-ранейшаму няма.
Кароткае правіла для лабараторнага стала
Стандартызуйце фарбавальнік, суадносіны, тэмпературу, змешванне, асвятленне і канчатковую кропку. Падавайце час разам з назвай метаду і ацэнкай. Інтэрпрэтуйце хвіліны з улікам гісторыі захоўвання, тыпу мікрафлоры, рэшткавых рэчываў і якасці адбору ўзору. Кароткі час сігналізуе пра актыўнасць, якую варта даследаваць. Доўгі час ніколі не пацвярджае бяспеку.