Артыкул
Метыленавы сіні ў лабараторных тэстах на G6PD: што насамрэч робіць фарбавальнік
Студэнт назірае за дзвюма прабіркамі пасля інкубацыі. Адна набыла чаканы колер. Другая — не. Студэнт робіць выснову, што ў другога пацыента дэфіцыт глюкоза-6-фасфатдэгідрагеназы. Гэтая выснова можа быць правільнай, але ў разважанні прапушчаны прынцып, на якім грунтуецца тэст. Нішто ў прабірцы не вымярае фермент непасрэдна. У прабірцы вымяраецца тое, што выпрацоўвае фермент, а метыленавы сіні выступае пасрэднікам.
Калі гэтая ўскоснасць становіцца зразумелай, працэдура, кантрольныя ўзоры і доўгі спіс памылковых вынікаў перастаюць здавацца адвольнымі.
Кароткі адказ
Метыленавы сіні ў тэстах на G6PD — гэта акісляльна-аднаўленчы індыкатар. Фермент G6PD выпрацоўвае NADPH, а NADPH-залежныя сістэмы аднаўляюць сіні метыленавы сіні да яго бясколернай лейкаформы або выкарыстоўваюць яго для пераносу электронаў. Нармальная актыўнасць ферменту забяспечвае эфектыўнае аднаўленне. Пры дэфіцыце актыўнасці аднаўленне павольнае або няпоўнае. У гэтым і заключаецца ўвесь сігнал.
Два гістарычныя метады выкарыстоўваюць адзін і той жа фарбавальнік, але адрозніваюцца канчатковым паказчыкам. Калі іх не блытаць, большасць непаразуменняў знікае.
Два тэсты, адзін фарбавальнік, розныя канчатковыя паказчыкі
Першы — тэст прамога аднаўлення метыленавага сіняга, апісаны Сасам і калегамі, а пазней ацэнены Гібсам. Тут канчатковы паказчык — сам фарбавальнік: акіслены сіні метыленавы сіні аднаўляецца да бясколернага лейкаметыленавага сіняга, а хуткасць гэтай змены адлюстроўвае здольнасць выпрацоўваць NADPH. Першапачатковая публікацыя пра скрынінг праіндэксаваная ў PubMed як праца Саса і суаўтараў (1966).
Другі — тэст Бруэра на аднаўленне метгемаглабіну. Спачатку нітрыт натрыю акісляе гемаглабін да карычневага метгемаглабіну. Затым метыленавы сіні дзейнічае як пасрэднік пераносу электронаў: адноўлены метыленавы сіні перадае аднаўленчыя эквіваленты метгемаглабіну, ператвараючы яго назад у чырвоны гемаглабін. Таму бачны канчатковы паказчык — карычневы колер у параўнанні з чырвоным, а не сіні ў параўнанні з бясколерным. Арыгінальны метад быў апублікаваны ў Бюлетэні Сусветнай арганізацыі аховы здароўя (Бруэр і суаўтары, 1960).
Называць тэст Бруэра тэстам абясколервання фарбавальніка хімічна недакладна. Фарбавальнік праходзіць цыкл ператварэнняў; колер змяняе гемаглабін. На схеме ніжэй паказаныя абодва шляхі.
Рэакцыя, якая ляжыць у аснове
G6PD каталізуе першы акісляльны этап пентозафасфатнага шляху:
Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
Спелыя эрытрацыты ў значнай ступені залежаць ад гэтага шляху як крыніцы NADPH, што разглядаецца ў аглядзе Луцата і калег у часопісе Blood (2020). NADPH падтрымлівае глутатыён у адноўленым стане і абараняе клетку ад акісляльнага пашкоджання. Метыленавы сіні ўключаецца ў гэтую сістэму як акцэптар электронаў. Дастатковая актыўнасць G6PD забяспечвае дастатковую колькасць NADPH, а тая — эфектыўнае аднаўленне. Нізкая актыўнасць G6PD разрывае ланцуг на самым першым звяне.
Уявіце фарбавальнік як паказальнік узроўню паліва, а не як рухавік. Ён паказвае забяспечанасць NADPH. Любы іншы фактар, які змяняе гэтую забяспечанасць або паказанні тэсту, можа зрушыць стрэлку без усялякай змены ў гене.
Як праводзіцца працэдура тыпу Бруэра
Рэцэптуры рэагентаў змяняліся на працягу дзесяцігоддзяў, таму навучальнае апісанне нельга прымаць за клінічны пратакол. Кожная лабараторыя прытрымліваецца ўласнай валідзіраванай стандартнай аперацыйнай працэдуры. З гэтай агаворкай класічны варыянт з прабіркамі выглядае наступным чынам; выкарыстанне трох прабірак і 3-гадзіннай інкубацыі апісана ў гэтай апублікаванай рэалізацыі:
- Прабірка з узорам пацыента: суцэльная кроў з даданнем глюкозы, нітрыту натрыю і метыленавага сіняга. Нітрыт утварае метгемаглабін, глюкоза забяспечвае метабалізм эрытрацытаў, а фарбавальнік забяспечвае NADPH-залежны перанос электронаў.
- Акіслены кантроль: кроў з даданнем нітрыту і глюкозы, але без метыленавага сіняга. Ён паказвае карычневы колер метгемаглабіну — карціну, характэрную для дэфіцыту.
- Гемаглабінавы кантроль: кроў з даданнем вады. Ён паказвае чырвоны колер гемаглабіну — нармальную карціну.
- Інкубуйце ўсе прабіркі пры тэмпературы каля 37 C, звычайна на працягу 3 гадзін, асцярожна змешваючы.
- Развядзіце невялікую аліквоту з кожнай прабіркі дыстыляванай вадой, каб выклікаць лізіс клетак і зрабіць колеры прыдатнымі для параўнання.
- Параўнайце прабірку з узорам пацыента з двума кантрольнымі ўзорамі. Вяртанне да чырвонага колеру паказвае на значную аднаўленчую здольнасць. Захаванне карычневага колеру дазваляе меркаваць пра выражаны дэфіцыт.
У адной з гістарычных рэцэптур выкарыстоўвалі каля 1 mL крыві з рэагентамі ў канцэнтрацыях каля 180 mM нітрыту натрыю, 280 mM дэкстрозы і 0.4 mM метыленавага сіняга. Успрымайце гэтыя лічбы як прыклад з літаратуры, а не як універсальную спецыфікацыю.
Інтэрпрэтацыя выніку
| Карціна | Выгляд у тэсце Бруэра | Значэнне |
|---|---|---|
| Нармальная | Колер прабіркі з узорам пацыента набліжаецца да чырвонага гемаглабінавага кантролю | Аднаўленчая здольнасць вышэйшая за парог скрынінгу |
| Дэфіцытная | Прабірка з узорам пацыента застаецца карычневай, блізкай да метгемаглабінавага кантролю | Скрынінг дазваляе меркаваць пра выражаны дэфіцыт G6PD |
| Прамежкавая | Колер знаходзіцца паміж колерамі кантрольных узораў | Не вызначайце фенатып; вымерайце актыўнасць колькасна |
Якасны скрынінг найлепш адрознівае вынікі каля ўзроўню ад 30 да 40 працэнтаў нармальнай актыўнасці, як абмяркоўваецца ў гэтым аглядзе пра прабелы ў выяўленні дэфіцыту G6PD у часопісе Malaria Journal. Таму нармальны вынік скрынінгу азначае, што тэст не выявіў цяжкага дэфіцыту. Ён не пацвярджае цалкам нармальную актыўнасць.
Чаму скрынінг можа ўводзіць у зман
Рэтыкулацытоз пасля гемолізу — класічная прычына ілжыва нармальнага выніку. Маладыя эрытрацыты і рэтыкулацыты ўтрымліваюць больш G6PD, чым старыя клеткі. Падчас вострага гемалітычнага эпізоду найстарэйшыя клеткі з найбольшым дэфіцытам могуць быць ужо разбураныя, пакідаючы маладую папуляцыю, актыўнасць якой у тэсце выглядае нармальнай. Гэты ж біялагічны механізм уводзіць у зман і колькасныя аналізы, а не толькі скрынінг з фарбавальнікам.
Нядаўняе пераліванне крыві маскіруе дэфіцыт, бо донарскія эрытрацыты дадаюць у ўзор уласны фермент. Mayo Clinic Laboratories называе пераліванне крыві сярод прычын ненадзейных вынікаў аналізу ферменту разам з рэтыкулацытозам і ўплывам лейкацытаў.
Гетэразіготныя жанчыны — самы складаны выпадак. Выпадковая інактывацыя X-храмасомы стварае сумесь нармальных эрытрацытаў і эрытрацытаў з дэфіцытам, а агульная актыўнасць можа знаходзіцца ў любым пункце дыяпазону ад выражанага дэфіцыту да ўяўнай нормы. Якасны скрынінг часта не выяўляе прамежкавыя фенатыпы. У дакументацыі СААЗ па тэставанні на G6PD гэтае абмежаванне разглядаецца падрабязна.
Даўнасць узору, тэмпература захоўвання, суб’ектыўнасць візуальнай ацэнкі канчатковага паказчыка, гематакрыт і якасць рэагентаў дадаюць аналітычны шум да гэтых біялагічных эфектаў.
Скрынінг — не дыягназ
Вынік скрынінгу, які паказвае дэфіцыт, з’яўляецца прамежкавым або не адпавядае клінічнай карціне, патрабуе колькаснага аналізу актыўнасці ферменту G6PD. СААЗ лічыць колькасную спектрафатаметрыю з кантролем тэмпературы рэферэнтным падыходам. У гэтым аналізе ў гемалізат эрытрацытаў дадаюць глюкоза-6-фасфат і NADP+, а ўтварэнне NADPH адсочваюць па павелічэнні аптычнай шчыльнасці пры 340 nm. Хуткасць змены прапарцыянальная актыўнасці ферменту, якую звычайна нармалізуюць адносна гемаглабіну і выражаюць у адзінках на грам. Сучасная практыка клінічных лабараторый абагульненая ў апісанні аналізу актыўнасці G6PD у каталогу Mayo.
Для інтэрпрэтацыі выкарыстоўваюць валідзіраваны лабараторыяй рэферэнтны дыяпазон, часта выражаны адносна нармальнай актыўнасці ў папуляцыі; дэфіцыт звычайна разглядаюць каля парога ў 30 працэнтаў, а прамежкавую актыўнасць — вышэй за яго. У мэтавых профілях прадуктаў СААЗ для тэстаў на G6PD (2022) выкладзены гэты дыягнастычны падыход. Калі нядаўні гемоліз або пераліванне крыві робяць фенатыпаванне ненадзейным, паўтарыце даследаванне пасля аднаўлення раўнавагі ў папуляцыі эрытрацытаў; малекулярнае тэставанне можа дадаць інфармацыю, але не замяняе вымярэнне актыўнасці ферменту.
Мяжа, якую варта захоўваць
Метыленавы сіні ў гэтых аналізах — лабараторны рэагент ex vivo. Гэта асобная тэма, адрозная ад бяспекі ўвядзення метыленавага сіняга пацыенту, якая разглядаецца ў рэкамендацыях па супрацьпаказаннях да метыленавага сіняга. Біяхімія звязвае гэтыя тэмы, бо прэпарат таксама залежыць ад NADPH-залежнага аднаўлення, але фарбавальнік у прабірцы — не доза ў крывацёку. Каб зразумець, як фарбавальнік паводзіць сябе пры афарбоўванні ў іншым кантэксце, глядзіце прынцыпы афарбоўвання метыленавым сінім, а каб даведацца пра хімічную групу, да якой ён належыць, — пра акісляльна-аднаўленчыя фарбавальнікі ў лабараторыі.
Скрынінг высвятляе, ці выглядае аднаўленчая здольнасць захаванай. Пацвярджальнае даследаванне высвятляе, колькі ферменту насамрэч прысутнічае. Фарбавальнік добра адказвае на першае пытанне, калі толькі ад яго не патрабуюць адказу на другое.