Метыленавы сіні ў даследаваннях даніа-рэрыа: дабаўка для ўтрымання і фактар скажэння эксперыментальных вынікаў

Вада для ікры даніа-рэрыа часта мае ледзь заўважны сіні колер, і амаль ніхто не запісвае, чаму. Фарбавальнік — гэта метыленавы сіні, які дадаюць супраць грыбкоў, а большасць пратаколаў лічыць яго фонам. Але паняцце фону тут недарэчнае. Дакладней будзе назваць яго неўлічаным эксперыментальным фактарам: рэчывам, якое прысутнічае ў доследных пасудзінах і адсутнічае ў кантрольных, фармакалагічна актыўнае пры выкарыстаных канцэнтрацыях і здольнае змяняць менавіта тыя паказчыкі, якія вымярае эксперымент.

Гэтае адрозненне вызначае структуру ўсяго, што ідзе далей. Звычайнае супрацьгрыбковае выкарыстанне пры ўтрыманні — адно пытанне. Ці нейтральная гэтая дабаўка для вашага аналізу — зусім іншае. Найноўшая літаратура па даніа-рэрыа дае заспакаяльны адказ на першае і трывожны — на другое.

Што насамрэч прадпісваюць рэкамендацыі

Адзінага стандарту няма, і гэта частка праблемы. Рэкамендацыі Канадскай рады па доглядзе жывёл дапускаюць 0.5 mg/L, або 0.00005%, у растворы для транспартавання ікры і лічынак, каб зменшыць рост грыбкоў. Еўрапейскія рэкамендацыі па лабараторных жывёлах апісваюць утрыманне эмбрыёнаў у асяроддзі, якое часта змяшчае тыя ж 0.00005%. Рэцэптура E3 ад Cold Spring Harbor прадугледжвае ўдвая большую колькасць, 1 mg/L або 0.0001%, як інгрэдыент асяроддзя. На гэтым фоне вылучаецца істотны пропуск: рэкамендацыі OECD па выпрабаванні таксічнасці на эмбрыёнах рыб прадпісваюць адноўленую ваду для развядзення і доследнае хімічнае рэчыва, але не рэкамендуюць метыленавы сіні ні ў версіі 2013 года, ні ў пазнейшай рэдакцыі. Такім чынам, адна лабараторыя вырошчвае эмбрыёны даніа-рэрыа ў сіняй вадзе з метыленавым сінім з першых гадзін жыцця, іншая праводзіць рэгулятарны аналіз на эмбрыёнах у бясколернай вадзе, і абедзве называюць сваё асяроддзе нармальным. Кожны, хто параўноўвае вынікі розных лабараторый або аб’ядноўвае гістарычныя кантрольныя даныя, сутыкаецца з гэтай неадпаведнасцю.

Для разумення канцэнтрацый: 0.00005% — гэта прыкладна 1.56 мікрамоляр, а 0.0001% — прыкладна 3.13 мікрамоляр. Значэнні нізкія, і ўзнікае спакуса палічыць іх занадта малымі, каб мець значэнне. Прыведзеныя ніжэй даследаванні правяраюць менавіта гэтае дапушчэнне і менавіта пры гэтых канцэнтрацыях.

Чытачы, якія прыйшлі з акварыумістыкі, а не з лабараторыі, сустракаюць тую ж малекулу ў іншым кантэксце, апісаным у акварыумным даведніку па метыленавым сінім. Хімія тая самая; тлумачэнне таго, як фарбавальнік пераносіць электроны ў клетках, паказвае, чаму акісляльна-аднаўленчае актыўнае злучэнне зноў і зноў з’яўляецца ў працах пра метабалізм. Далей гаворка ідзе менавіта пра ваду для ікры даніа-рэрыа з метыленавым сінім.

Метабалізм: эфект змяняе знак у залежнасці ад стадыі

У найбольш інфарматыўным даследаванні даніа-рэрыа з нармальным развіццём падвяргалі ўздзеянню з першага дня жыцця да 5 дзён пасля апладнення і вымяралі акісляльны метабалізм на кожнай стадыі, як апісана ў апублікаванай справаздачы пра эксперыменты з метабалізмам эмбрыёнаў. Гэтую заканамернасць варта выкласці дакладна, бо кірунак эфекту змяняецца на супрацьлеглы.

На 1 дзень пасля апладнення базальнае спажыванне кіслароду ў эмбрыёнаў, якія падвяргаліся ўздзеянню, павялічвалася пры абедзвюх канцэнтрацыях, ужываных пры ўтрыманні. На 2 дзень мембранны патэнцыял мітахондрый у паверхневым слоі лічынак быў павышаны пры ўздзеянні 0.00005%, 0.0001% і 0.0003%. Да 4–5 дзён, пасля вылуплення, знак змяніўся: акісляльныя энергавыдаткі зніжаліся незалежна ад таго, ці было ўздзеянне бесперапынным з моманту апладнення, ці кароткачасовым толькі з 3 да 4 дня. Паралельна на 1 і 4 дзень зніжалася колькасць транскрыптаў субадзінак мітахандрыяльных дыхальных комплексаў, а таксама транскрыптаў, звязаных са стэроідагенезам і глюканеагенезам.

Яшчэ два назіранні ўдакладняюць карціну. Пры вышэйшай канцэнтрацыі, ужыванай пры ўтрыманні, вылупленне адбывалася крыху раней: на 2 дзень эмбрыёны, якія падвяргаліся ўздзеянню, апярэджвалі кантрольныя, але да 3 дня кантрольныя іх даганялі. Пры гэтым сама стрэсавая вось, відаць, заставалася захаванай: калі 5-дзённыя лічынкі падвяргалі стрэсаваму ўздзеянню закручвання вады, узровень картызолу ва ўсім арганізме нармальна павышаўся ў абедзвюх групах. Такім чынам, пры гэтых дозах фарбавальнік не з’яўляецца агульным таксічным фактарам для развіцця і не прыгнятае ўсе фізіялагічныя рэакцыі. Ён змяняе энергетычны метабалізм у залежнасці ад стадыі: павышае яго да вылуплення і зніжае пасля.

Паводзіны: чаму два даследаванні разыходзяцца і чаму абодва могуць быць правільнымі

Літаратура пра паводзіны здаецца супярэчлівай, пакуль схемы ўздзеяння не параўнаць побач. У адным даследаванні бяспекі для развіцця і паводзін эмбрыёны прыкладна з 6 гадзін пасля апладнення падвяргалі ўздзеянню канцэнтрацый да 10 мікрамоляр, штодня абнаўлялі растворы да 4 дня, затым на 5 і 6 дні пераносілі лічынак у асяроддзе без фарбавальніка і на 6 дзень правяралі рухальную актыўнасць у светла-цемнавым тэсце. Вынік: ніякага значнага ўплыву на смяротнасць, вылупленне або марфалогію і ніякага ўплыву ўздзеяння на рухальную актыўнасць. Аўтары абгрунтавана рэкамендавалі 10 мікрамоляр як верхнюю мяжу ў іх умовах.

Другая група, частка аўтараў якой таксама ўдзельнічала ў даследаванні метабалізму, праводзіла ўздзеянне так, як гэта адбываецца пры звычайным утрыманні: фарбавальнік прысутнічаў з 2–3 гадзін пасля апладнення са штодзённым частковым абнаўленнем, а паводзіны вымяралі падчас уздзеяння або неўзабаве пасля яго. Пры тых жа звычайных канцэнтрацыях лічынкі паказвалі зніжаную рухальную актыўнасць у 24-гадзінным тэсце, што ўзнаўлялася ў розных лініях і лабараторыях, а даследаванне скажэння паводзінскіх вынікаў звязала эфект з сератанінергічным тонусам, што адпавядае вядомай здольнасці фарбавальніка інгібіраваць монаамінаксідазу. Найбольш паказальна, што асяроддзе для эмбрыёнаў з метыленавым сінім маскіравала чаканую рухальную рэакцыю на флуаксецінавы СІЗЗС. Такім чынам, скрынінгавы аналіз у сіняй вадзе можа не выявіць эфект прэпарату, які выявіўся б у бясколернай вадзе.

Сапраўднай супярэчнасці няма. У адным аналізе праз два дні пасля выдалення злучэння можа не заставацца выяўнага рэшткавага эфекту, але ў іншым яно ўсё яшчэ можа дзейнічаць, пакуль прысутнічае. Практычная выснова такая: нулявы вынік абгрунтоўвае верхнюю мяжу канцэнтрацыі, а не сцвярджэнне пра нейтральнасць, тады як станоўчы вынік апісвае істотную рызыку — актыўнае ўздзеянне ў перыяд вымярэння ў той самай схеме, якой карыстаецца большасць лабараторый.

Акісляльна-аднаўленчы фарбавальнік у акісляльна-аднаўленчым аналізе

Яшчэ адна пастка заслугоўвае асобнага абзаца, бо яна ўплывае не на жывёлу, а на інструмент вымярэння. Аналіз энергавыдаткаў Alamar Blue сам заснаваны на акісляльна-аднаўленчай хіміі: рэзазурын аднаўляецца да флуарэсцэнтнага рэзаруфіну. Метыленавы сіні таксама ўдзельнічае ў акісляльна-аднаўленчых рэакцыях. У бесклетачных кантрольных пробах абедзве канцэнтрацыі, ужываныя пры ўтрыманні, праз 24 гадзіны нязначна, але статыстычна значна зніжалі флуарэсцэнцыю Alamar Blue. У эксперыментах на жывёлах эмбрыёны пасля ўздзеяння прамывалі не менш за тры разы ў асяроддзі без фарбавальніка перад аналізам, а біялагічны эфект у лічынак пасля вылуплення перавышаў бесклетачную інтэрферэнцыю. Такім чынам, абодва сцвярджэнні праўдзівыя: у прамытых жывёл захоўваецца рэальны метабалічны эфект, а нязмыты фарбавальнік дадае да яго прамы хімічны артэфакт. Кантрольныя пробы павінны раздзяляць гэтыя два эфекты, інакш ніводнае значэнне не мае сэнсу. Агульныя рэкамендацыі па інтэрпрэтацыі вынікаў аналізаў на аснове фарбавальнікаў тут асабліва важныя.

Храналогія стадый развіцця

Арыгінальны матэрыял для гэтага артыкула. Калі не пазначана іншае, канцэнтрацыі — гэта два стандартныя значэнні для ўтрымання: 0.00005% і 0.0001%.

Варта запомніць агульную карціну: ранняе павышэнне і пазнейшае зніжэнне метабалічных паказчыкаў, пры гэтым паводзінскія эфекты прысутнічаюць падчас уздзеяння і не выяўляюцца пасля вывядзення рэчыва ў адзіным аналізе, які гэта правяраў.

Кантрольны спіс для планавання кантролю

Другі арыгінальны матэрыял. Выкарыстоўвайце яго, калі пратаколы ўтрымання даніа-рэрыа з метыленавым сінім перасякаюцца з эксперыментам.

1. Указвайце фарбавальнік як рэагент, а не як ваду. Пазначайце канцэнтрацыю і ў працэнтах, і ў мікрамолярах, пачатак і канец уздзеяння ў гадзінах або днях пасля апладнення, графік абнаўлення і інтэрвал выдалення фарбавальніка перад кожным вымярэннем.
2. Падбірайце кантроль адпаведна пытанню. Даследаванне доследнага хімічнага рэчыва патрабуе кантролю без фарбавальніка; даследаванне ўтрымання патрабуе груп без фарбавальніка і з ім з рэгістрацыяй супрацьгрыбковага выніку, паколькі ніводнае з цытаваных даследаванняў не вымярала супрацьгрыбковую эфектыўнасць.
3. Прамывайце перад акісляльна-аднаўленчымі аналізамі, а затым правярайце. Прамывайце не менш за тры разы ў асяроддзі без фарбавальніка і паралельна праводзьце бесклетачны кантроль з фарбавальнікам і рэагентам, бо фарбавальнік непасрэдна зніжае сігнал Alamar Blue.
4. Лічыце паводзінскія і монаамінавыя паказчыкі зонай высокай рызыкі. Даследаванні рухальнай актыўнасці, рэакцыі спалоху, трывожнападобных паводзін, антыдэпрэсантаў і інгібітараў MAO павінны выключаць фарбавальнік падчас вымярэння або дэманстраваць яго нейтральнасць для канкрэтнага паказчыка; перыяд выдалення фарбавальніка ў адзін-два дні ліквідаваў адзін рухальны эфект, але гэта не даказана для іншых эксперыментальных схем.
5. Лічыце метабалічныя і мітахандрыяльныя паказчыкі зонай высокай рызыкі на кожнай стадыі. Спажыванне кіслароду, энергавыдаткі, мембранны патэнцыял і транскрыпты дыхальнага ланцуга змяняюцца пры канцэнтрацыях, ужываных пры ўтрыманні, прычым у супрацьлеглых кірунках да і пасля вылуплення.
6. Не пераносьце выснову пра нейтральнасць паміж схемамі. Нулявы вынік пасля выдалення фарбавальніка не распаўсюджваецца на бесперапыннае ўздзеянне; нулявы марфалагічны вынік не распаўсюджваецца на метабалізм або ўзаемадзеянне з прэпаратамі; вынік для адной лініі, тэмпературы або працягласці аналізу не распаўсюджваецца на іншыя.
7. Указвайце рэкамендацыі, якіх вы прытрымліваліся, і іх альтэрнатыву. Яўна называйце канцэнтрацыі паводле CCAC, еўрапейскіх рэкамендацый або Cold Spring Harbor і адзначайце, дзе тэст OECD на эмбрыёнах не прадугледжвае фарбавальніка, каб чытач мог зразумець умовы ўтрымання вашых жывёл.

Нішто з гэтага не з’яўляецца аргументам супраць выкарыстання фарбавальніка для захавання жыццяздольнасці ікры. Гэта аргумент супраць таго, каб рашэнне аб умовах утрымання непрыкметна і без праверкі ўплывала на даныя. Сіні колер у пасудзіне — гэта малекула з фармакалагічнымі ўласцівасцямі, а найбольш схільныя да скажэння менавіта тыя высокапрадукцыйныя метабалічныя і нейрапаводзінскія скрынінгі, для якіх цяпер аддаюць перавагу маладым даніа-рэрыа. Дакументуйце яго, кантралюйце, выдаляйце перад вымярэннем і правярайце аналіз, у якім ён можа незаўважна ўдзельнічаць.