Метыленавы сіні і прагерыя: урокі клетачнай мадэлі старэння

Змена адной літары ў адным гене прымушае дзяцей старэць з жахлівай хуткасцю. Выпадзенне валасоў, скаванасць суставаў, звужэнне артэрый і чаканая працягласць жыцця толькі да падлеткавага ўзросту. Гэта захворванне — сіндром прагерыі Хатчынсана — Гілфарда, і гадамі яго даследаванні былі засяроджаныя на ядры, дзе мутантны бялок наносіць шкоду. У даследаванні Мэрылендскага ўніверсітэта 2016 года паставілі іншае пытанне: як выглядаюць мітахондрыі ў гэтых клетках? Адказ звязаў два аддзелы клеткі, і сіні фарбавальнік з больш чым стогадовай гісторыяй паўплываў на абодва.

Гэта даследаванне Сюн і калег, апублікаванае ў Aging Cell у 2016 годзе. Яно цалкам праводзілася на культываваных клетках. Гэты факт вызначае, як трэба разумець усё, што апісана ніжэй. Вынікі рэальныя і канкрэтныя. Іх аддаленасць ад любога лячэння гэтак жа выразная.

Мадэль: адна мутацыя, адзін ліпкі бялок

Прагерыя пачынаецца з замены C на T у пазіцыі 1824 гена LMNA. Гэтая змена не змяняе амінакіслату. Яна актывуе схаваны ўчастак сплайсінгу, у выніку чаго з бялку ламіну A выдаляюцца 50 амінакіслот. Скарочаны прадукт, які называецца прагерыным, губляе ўчастак расшчаплення, што ў норме дазваляе клетцы выдаліць яго фарнезільны якар. Таму прагерын застаецца пастаянна фарнезіляваным і прымацаваным да ўнутранай мембраны ядра, тады як нармальны ламін A перыядычна прымацоўваецца да яе і аддзяляецца.

Наступствы для ядра добра задакументаваныя і бачныя пад мікраскопам. Замест гладкай авальнай формы ядры ўтвараюць выпінанні і зморшчыны. Гетэрахрамацін — шчыльна ўпакаваная неактыўная ДНК, якая ў норме размяшчаецца ўздоўж краю ядра, — радзее. Змяняецца экспрэсія тысяч генаў. Уявіце ядзерную ламіну як каркас пад шпалерамі: калі адзін элемент каркаса прывараны ў няправільным становішчы, сцяна выпінаецца, а ўзор шпалераў скажаецца па ўсім пакоі.

У даследаванні выкарыстоўвалі фібрабласты скуры пацыентаў з прагерыяй разам з кантрольнымі клеткамі з такой жа колькасцю пасажаў, а таксама другую лінію, мадыфікаваную так, каб нармальныя фібрабласты непасрэдна выпрацоўвалі прагерын. У мадыфікаваных клетках узніклі тыя ж дэфекты, што паказвае на прагерын як прычыну, а не на анамнез пацыентаў ці працягласць культывавання. Выяўленасць дэфектаў залежала ад колькасці прагерыну: у лініі з вышэйшай яго экспрэсіяй усе дэфекты былі мацнейшыя.

Як выглядалі мітахондрыі

Мітахондрыі здаровых фібрабластаў утвараюць разгалінаваную сетку вакол ядра — доўгія трубачкі, якія перамяшчаюцца ўздоўж шляхоў цыташкілета. У лініях з прагерыяй гэтая сетка знікала. Большая доля мітахондрый была фрагментаваная, многія былі набраклыя, а электронная мікраскапія паказала прыблізна двухразовае павелічэнне колькасці моцна пашкоджаных арганэл. Здымка праз пэўныя інтэрвалы часу паказала, што яны перамяшчаліся на карацейшыя адлегласці і з меншай хуткасцю, чым у кантрольных клетках.

Функцыя змянялася ўслед за формай. Узроўні мітахандрыяльнага супераксіду і акісляльнікаў ва ўсёй клетцы павышаліся. У большай колькасці клетак назіраліся парушэнні мембраннага патэнцыялу. Выпрацоўка ATP зніжалася. Паасобку нічога з гэтага не здзіўляе, бо пашкоджаныя мітахондрыі вылучаюць актыўныя формы кіслароду і выпрацоўваюць менш энергіі. Новай была прапанаваная прычына. PGC-1alpha — каактыватар транскрыпцыі, які стымулюе біягенез мітахондрый праз фактары наступных звёнаў, такія як NRF1, TFAM, і рэгулятары зліцця і дзялення MFN1, MFN2, OPA1, FIS1 і DRP1, — у клетках з прагерыяй быў прыгнечаны прыкладна ў восем разоў на ўзроўні мРНК, з адпаведным зніжэннем колькасці бялку. Здавалася, што прагерын прыгнятае галоўны пераключальнік стварэння і падтрымання мітахондрый. Гэтая сувязь паміж пашкоджаннем ядзернай ламіны і энергетычным абменам — частка шырэйшага апісання выпрацоўкі энергіі мітахондрыямі, а акісляльны бок таго ж балансу разглядаецца ў матэрыяле пра акісляльны стрэс і кантроль актыўных формаў кіслароду.

Што змяніў метыленавы сіні

Даследчыкі бесперапынна на працягу некалькіх тыдняў апрацоўвалі клеткі метыленавым сінім у нізкай канцэнтрацыі — 100 нанамоль/л. Для клетачнай культуры гэта працяглае мяккае ўздзеянне, а не кароткі імпульс прэпарату. Метыленавы сіні цыклічна пераходзіць паміж акісленай і адноўленай формамі і можа пераносіць электроны ўнутры мітахондрый. Таму яго апісваюць як акісляльна-аднаўленчае злучэнне, накіраванае на мітахондрыі, а не як звычайны антыаксідант, які расходуецца пры нейтралізацыі аднаго акісляльніка.

Мітахондрыі рэагавалі як у нармальных клетках, так і ў клетках з прагерыяй. Узровень ATP павышаўся, узроўні акісляльнікаў зніжаліся, а доля мітахондрый з цяжкімі дэфектамі змяншалася. Экспрэсія PGC-1alpha часткова аднаўлялася разам з некаторымі яго мішэнямі ў наступных звёнах. Да гэтага моманту гаворка ідзе пра агульны эфект падтрымання мітахондрый, не спецыфічны для прагерыі.

Вынікі на ўзроўні ядра сталі нечаканасцю і былі спецыфічныя для хворых клетак. Колькасны аналіз формы паказаў памяншэнне выпінанняў ядра. Агульная колькасць ламінаў A і C павялічылася. Найбольш прыкметным стала пераразмеркаванне прагерыну: у неапрацаваных клетках з прагерыяй толькі каля 30 працэнтаў прагерыну знаходзілася ў растваральнай нуклеаплазматычнай фракцыі, а астатняя частка была замацаваная на мембране. Пасля апрацоўкі растваральная доля павялічылася прыблізна да 65 працэнтаў, што набліжалася да паводзін нармальнага ламіну. Вызвалены ад мембраны прагерын цягне за сабой менш суседніх бялкоў, і растваральныя фракцыі ламінаў A і C таксама аднавіліся.

У выніку гэтага вызвалення палепшыліся два ядзерныя фенатыпы. Гетэрахрамацін па перыферыі ядра, даследаваны з дапамогай электроннай мікраскапіі і афарбоўвання на бялок гетэрахрамаціну HP1-alpha, прыкметна аднавіўся. А секвенаванне РНК паказала, што транскрыптом набліжаецца да нормы: неапрацаваныя клеткі з прагерыяй адрозніваліся ад кантрольных па больш чым 3,200 генах, а апрацаваныя — прыкладна па 1,670. У нармальных клетках такая ж апрацоўка змяніла толькі некалькі дзясяткаў генаў. Гэта сведчыць, што ядзерны эфект звязаны з прагерыным, а не з агульным рэзкім зрухам транскрыпцыі. Прынцып, паводле якога клетачныя і жывёльныя мадэлі адказваюць на вузейшыя пытанні, чым можна меркаваць з загалоўкаў, тлумачыцца ў матэрыяле як чытаць даследаванні метыленавага сіняга.

Чаму гэта не лячэнне

Чатыры абмежаванні пакідаюць гэтае даследаванне там, дзе яму месца: у лабараторыі.

Па-першае, усё адбывалася ў чашках. Фібрабласты ў культуры не маюць кровазабеспячэння, імуннага асяроддзя, тканкавай архітэктуры і фармакалогіі цэлага арганізма, якая вызначае, ці ўвогуле дасягне злучэнне мішэні. У гэтай працы рэчыва не ўводзілі ніводнай жывёле і не лячылі ніводнага пацыента.

Па-другое, фібрабласты з прагерыяй — гэта мадэль аднаго тыпу клетак. Захворванне прыводзіць да смерці пераважна праз паражэнне артэрый, касцявой і тлушчавай тканак, а ў даследаванні правяралі толькі фібрабласты і адну мадэль гладкамышачных клетак. Іншыя тканкі могуць паводзіць сябе інакш.

Па-трэцяе, аднаўленне ядра было вынікам тыдняў бесперапыннага ўздзеяння нанамалярнай канцэнтрацыі ў культуральным асяроддзі. Канцэнтрацыі ў чашках — гэта не дозы, і нішто ў артыкуле не дазваляе пераўтварыць 100 нанамоль/л у асяроддзі ў схему прымянення для чалавека. У іншых медыцынскіх кантэкстах метыленавы сіні мае сваю залежнасць эфекту ад дозы і свой профіль бяспекі, і гэтае даследаванне не дае падстаў для хатняга выкарыстання. Агульны кантэкст бяспекі разглядаецца ў матэрыяле бяспека і пабочныя эфекты метыленавага сіняга.

Па-чацвёртае, прагерыя — гэта не нармальнае старэнне. Гэта рэдкае захворванне, выкліканае адной мутацыяй, пры якім ядзерны каркас пашкоджваецца пэўным чынам. Злучэнне, якое змякчае такое канкрэтнае пашкоджанне ў культываваных клетках, мала што кажа пра старэнне людзей без гэтай мутацыі. Клетачны фенатып дазваляе зазірнуць ва ўзаемадзеянне ядра і мітахондрый, але не з'яўляецца вынікам даследавання даўгалецця.

Таму карэктная выснова павінна мець агаворкі. У фібрабластах з прагерыяй прагерын прыгнятае PGC-1alpha, у выніку чаго мітахондрыі становяцца фрагментаванымі, маларухомымі, з высокім узроўнем акісляльнікаў і нізкай выпрацоўкай энергіі. Метыленавы сіні ў нізкай канцэнтрацыі аднаўляў мітахандрыяльныя паказчыкі ва ўсіх клетках і дадаткова вызваляў прагерын з ядзернай мембраны ў хворых клетках, з частковым аднаўленнем формы ядра, гетэрахрамаціну і экспрэсіі генаў. Гэтае падвойнае дзеянне робіць даследаванне вартым увагі. Яно не робіць метыленавы сіні сродкам лячэння прагерыі ці старэння.