Метыленавы сіні і запаленчая сігналізацыя: інфламасомы, IL-6 і STAT3

Уявім, што тры лабараторыі паведамляюць пра супрацьзапаленчае дзеянне аднаго і таго ж сіняга злучэння. Адна паказвае зніжэнне выдзялення IL-1beta макрафагамі. Другая — меншую колькасць ферменту iNOS у тым жа тыпе клетак. Трэцяя — меншую колькасць IL-6 у крыві і ніжэйшую актыўнасць STAT3 у мозгу. Узнікае спакуса аб’яднаць усе тры вынікі ў адно сцвярджэнне. Такое аб’яднанне хавае сутнасць вынікаў.

Кожны вынік адносіцца да асобнага механізму сігналізацыі са сваім пускавым фактарам, этапам зборкі і вымяральным паказчыкам. Метыленавы сіні ўздзейнічае на кожны механізм у розным пункце. Ці паляпшае нешта з гэтага вынікі для здароўя — асобнае пытанне, разгледжанае ў нашым аглядзе метыленавага сіняга і запалення. Гэтая старонка прысвечана сігнальным шляхам.

Шлях 1: зборка інфламасомы і каспаза-1

Інфламасома — гэта бялковы каркас, які ўтвараецца па патрэбе ўнутры міелаіднай клеткі. Яго складнікі — сэнсар, адаптар пад назвай ASC і эфектарны фермент пад назвай каспаза-1. Пасля зборкі каспаза-1 расшчапляе pro-IL-1beta і pro-IL-18 да формаў, якія сакрэтуюцца, і можа запускаць піраптоз — запаленчую форму гібелі клетак. Тып вызначаецца сэнсарам: NLRP3 рэагуе на крышталі і пораутваральныя таксіны, такія як нігерыцын, а таксама на ATP; NLRC4 рэагуе на бактэрыяльны флагелін; AIM2 рэагуе на двухланцуговую ДНК у цытазолі; а некананічны шлях рэагуе на ўнутрыклетачны ліпапаліцукрыд.

Для актывацыі патрэбныя два сігналы. Першы сігнал — падрыхтоўка: ліганд Toll-падобнага рэцэптара запускае NF-kB-залежную транскрыпцыю NLRP3 і pro-IL-1beta, забяспечваючы наяўнасць патрэбных складнікаў. Другі сігнал — зборка: дадатковы пускавы фактар выклікае алігамерызацыю ASC з утварэннем кропкавых агрэгатаў, расшчапленне каспазы-1 з утварэннем фрагмента p20 і выдзяленне спелага IL-1beta p17. Вядома, што мітахандрыяльныя актыўныя формы кіслароду і паглынанне крышталяў спрыяюць другому сігналу для NLRP3.

У даследаванні шырокага інгібіравання інфламасом у макрафагах 2017 года метыленавы сіні правяралі на абодвух этапах сігналізацыі. У макрафагах касцявога мозгу мышэй, папярэдне падрыхтаваных ліпапаліцукрыдам, нігерыцын, ATP і крышталі монаўрату натрыю выклікалі выдзяленне IL-1beta і каспазы-1, а таксама ўтварэнне кропкавых агрэгатаў ASC. Метыленавы сіні ў канцэнтрацыі ад 20 да 200 micromolar зніжаў усе тры паказчыкі дазазалежным чынам, не забіваючы клеткі. Флагелін і Salmonella для NLRC4, двухланцуговая ДНК і Listeria для AIM2, а таксама ліпапаліцукрыд, уведзены шляхам трансфекцыі, або жывыя E. coli для некананічнага шляху давалі такую ж карціну. Само злучэнне не выклікала выдзялення, а ў кантрольных планшэтах не выяўлялася антыбактэрыяльнага эфекту, таму вынік адносіцца да адказу арганізма-гаспадара.

На папярэдніх этапах вымяралі тры эфекты ўмяшання. Метыленавы сіні зніжаў колькасць мітахандрыяльнага супераксіду, выкліканага ротэнонам, і разам з ёй зніжалася выдзяленне IL-1beta, выкліканае ротэнонам. Паглынанне флуарэсцэнтных мікрашарыкаў памяншалася, што адпавядае зніжэнню фагацытозу да распазнавання крышталяў. Рэпарцёр пад кантролем прамотара NLRP3 з двума сайтамі NF-kB паказваў ніжэйшую актыўнасць у прысутнасці метыленавага сіняга, тады як скарочаны прамотар без гэтых сайтаў не рэагаваў. У прабірцы без клетак метыленавы сіні таксама непасрэдна зніжаў актыўнасць рэкамбінантнай каспазы-1 чалавека. Даданне злучэння толькі на этапе падрыхтоўкі або толькі на этапе актывацыі ўсё роўна зніжала выдзяленне IL-1beta, IL-18 і каспазы-1, таму задзейнічаныя абодва этапы.

Выпрабаванні на мышах пацвердзілі гэтую выбіральнасць. Смяротная доза ліпапаліцукрыду забівала кантрольных жывёл на працягу некалькіх гадзін, тады як метыленавы сіні павышаў выжывальнасць; узровень IL-1beta ў перытанеальнай вадкасці зніжаўся, але ўзровень IL-6 у той жа вадкасці — не. У мадэлі перытаніту, выкліканага Listeria, узровень IL-1beta ў перытанеальнай вадкасці зніжаўся, а агульная колькасць клетак не змянялася. Манацыты чалавека THP-1 паводзілі сябе падобна да макрафагаў мышэй для ўсіх чатырох тыпаў інфламасом. Вынік, звязаны з інфламасомай, тлумачыць паспяванне IL-1beta і IL-18, а не змены ўсіх цытакінаў. Таму і форма імунных клетак мозгу ў эксперыментах з мікрагліяй і астрацытамі адказвае на іншае пытанне, чым зборка бялковага каркаса.

Шлях 2: транскрыпцыя iNOS праз звязванне NF-kB і STAT1

Індуцыбельная сінтаза аксіду азоту, або iNOS, амаль адсутнічае ў стане спакою, а транскрыпцыя яе гена запускаецца па патрэбе. Ліпапаліцукрыд стымулюе яе пераважна праз дэградацыю IkB-alpha з наступным фасфарыляваннем NF-kB і яго ўваходам у ядро. Інтэрферон-гама стымулюе яе пераважна праз фасфарыляванне STAT1 Янус-кіназай з наступным уваходам STAT1 у ядро. Затым кожны фактар звязваецца са сваім сайтам на прамотары iNOS. Актыўнасць ферменту і індукцыя гена — асобныя пункты кантролю, і прэпарат можа ўздзейнічаць на адзін з іх або на абодва.

У даследаванні індукцыі iNOS у макрафагах і мышах з эндатаксеміяй 2015 года эфект быў выяўлены на ўзроўні мРНК. У клетках RAW 264.7 і першасных макрафагах мышэй метыленавы сіні ў канцэнтрацыі 1 micromolar, дададзены за 30 хвілін да ліпапаліцукрыду, інтэрферону-гама або іх спалучэння, зніжаў колькасць бялку iNOS і яго мРНК на працягу ад 8 да 24 гадзін. Пры гэтым у асяроддзі было менш нітрыту, а жыццяздольнасць клетак не зніжалася. У мышэй, якія атрымлівалі 25 mg ліпапаліцукрыду на kg масы цела, аднаразовая доза метыленавага сіняга 5 mg на kg за адну гадзіну да гэтага зніжала колькасць бялку iNOS і яго мРНК у лёгкіх, печані і сэрцы.

Адметная дэталь — тое, што не змянілася. Дэградацыя IkB-alpha, фасфарыляванне NF-kB, фасфарыляванне STAT1 і назапашванне абодвух фактараў у ядры захоўваліся. Парушэнне адбывалася на наступным этапе: у ядзерных экстрактах назіралася меншае звязванне NF-kB з яго элементам ДНК пасля ўздзеяння ліпапаліцукрыду і меншае звязванне STAT1 пасля ўздзеяння інтэрферону-гама. Імунапрэцыпітацыя храмаціну пацвердзіла меншую занятасць прамотара iNOS кожным з гэтых фактараў унутры клетак. Узровень фактару некрозу пухлін альфа, прамотар якога таксама выкарыстоўвае NF-kB, таксама зніжаўся. Фактары актываваліся і дасягалі ядра, але слаба звязваліся са сваёй мішэневай ДНК.

Звярніце ўвагу на адрозненне ад шляху 1. Тут гаворка ідзе пра звязванне фактару з ДНК, задзейнічаны STAT1, а не STAT3, і вымяраюцца мРНК, бялок і нітрыт, а не кропкавыя агрэгаты ASC і фрагменты каспазы-1. Наша карта мішэняў метыленавага сіняга ў клетачных мадэлях разглядае гэты транскрыпцыйны ўзровень асобна ад непасрэдных вымярэнняў ферментатыўнай актыўнасці і мітахандрыяльных працэсаў.

Шлях 3: IL-6 у сыроватцы і актывацыя STAT3 у тканках

IL-6 перадае сігнал праз сямейства рэцэптараў gp130 у каскад ад Янус-кіназы да STAT3. Фасфарыляваны STAT3 дымерызуецца, уваходзіць у ядро і запускае запаленчыя праграмы. Пры гэтым сам IL-6 з’яўляецца мішэнню NF-kB, таму гэтыя кампаненты ўтвараюць пятлю зваротнай сувязі, якую часта называюць воссю IL-6–STAT3. Стандартныя паказчыкі — узровень IL-6 у сыроватцы на пачатку шляху, суадносіны фасфарыляванага і агульнага STAT3, а таксама эфектарныя ферменты, такія як iNOS і COX2, на наступных этапах.

У даследаванні IL-6 і STAT3 пасля ўздзеяння ліпапаліцукрыду на мышэй 2023 года гэтую вось ацэньвалі ў розных асяроддзях і тканках. Самцы мышэй C57BL/6 атрымлівалі 1 mg ліпапаліцукрыду на kg масы цела штодня на працягу трох дзён, а праз 30 хвілін пасля кожнай дозы — 5 або 10 mg метыленавага сіняга на kg. На трэці дзень узровень IL-6 у сыроватцы быў ніжэйшы ў абедзвюх групах метыленавага сіняга, чым у групе толькі ліпапаліцукрыду, тады як большасць іншых цытакінаў у панэлі не змянялася пад уплывам увядзення злучэння. Суадносіны фасфарыляванага і агульнага STAT3 былі ніжэйшыя ў кары мозгу, гіпакампе і скуры вуха; таксама адзначаліся слабейшае афарбоўванне мікрагліі на Iba-1, ніжэйшыя ўзроўні iNOS і COX2 і часткова меншая страта масы цела.

Тут патрэбныя дзве агаворкі. Ніжэйшы ўзровень IL-6 у сыроватцы разам з меншым фасфарыляваннем STAT3 у тканках адпавядае мадуляцыі гэтай восі, але не дазваляе вызначыць першаснае звяно ўздзеяння: меншая колькасць цытакіну на папярэднім этапе, слабейшая рэцэптарная сігналізацыя або змененая актыўнасць фасфатаз могуць даваць аднолькавыя суадносіны. Акрамя таго, маса цела на працягу трох дзён вострага ўздзеяння — паказчык на ўзроўні ўсёй жывёлы, а не ацэнка сімптомаў або рэмісіі. Ён дадае кантэкст да вынікаў блотынгу, але не ператварае вынік даследавання сігналізацыі ў сцвярджэнне пра лячэнне. Асобныя хімічныя працэсы рэгуляцыі акісляльна-аднаўленчага стану мітахондрый ідуць паралельна з гэтымі цытакінавымі механізмамі, і іх не варта аб’ядноўваць.

Параўнанне шляхоў: пункты ўздзеяння і вымяральныя паказчыкі

Табліца перашкаджае тром неабгрунтаваным пераносам высноў. Вынік для кропкавых агрэгатаў ASC не даказвае выніку для STAT3. Вынік для звязвання STAT1 з прамотарам iNOS не даказвае выніку для STAT3, хоць абодва бялкі належаць да сямейства STAT. Вынік для IL-6 у сыроватцы не даказвае зніжэння зборкі інфламасомы: у перытанеальным эксперыменце ўзровень IL-1beta зніжаўся, а IL-6 — не. Кожны радок патрабуе ўласнага пускавога фактару і вымяральнага паказчыка. Таму пры чытанні клетачных, жывёльных і клінічных даследаванняў метыленавага сіняга неабходна суадносіць кожнае сцвярджэнне з узроўнем, на якім праводзіліся вымярэнні.

Нішто з гэтага не вызначае дазаванне, бяспеку або карысць для людзей. Ліпапаліцукрыдныя мадэлі — гэта кантраляваныя ўздзеянні для праверкі механізму, а не копіі хранічных захворванняў. Увядзенне злучэння разам з пускавым фактарам правярае прадухіленне выкліканай змены, а не зваротнае развіццё ўжо наяўнага захворвання. Разглядайце гэты апісаны механізм асобна ад вынікаў у пацыентаў і ацэньвайце любое сцвярджэнне пра здароўе паводле даследавання на пацыентах, якое за ім стаіць.