Метыленавы сіні і БАС: чаму вынікі адрозніваюцца паміж эксперыментальнымі мадэлямі

Калі шукаць інфармацыю пра метыленавы сіні і БАС, можна знайсці два сцвярджэнні, якія, здаецца, супярэчаць адно аднаму. Паводле аднаго, сіні фарбавальнік абараняў нейроны ў мадэлях БАС. Паводле другога, ён нічога не змяніў у мышынай мадэлі БАС. Абодва сцвярджэнні спасылаюцца на рэальныя навуковыя працы, і абедзве працы заслугоўваюць сур’ёзнага стаўлення. Супярэчнасць знікае, калі сфармуляваць прынцып, які ляжыць у аснове кожнага эксперыменту: мадэль вызначае межы сцвярджэння.

Вынік на чарвяку — гэта сцвярджэнне пра чарвяка. Вынік на лічынцы рыбы — гэта сцвярджэнне пра лічынку рыбы. Ні адзін з іх не становіцца сцвярджэннем пра пацыента, пакуль яго не пацвердзіць даследаванне ходу захворвання ў млекакормячых. У гэтым артыкуле дзве найбольш цытаваныя працы параўноўваюцца побач, каб вы маглі ўбачыць, чаму іх высновы адрозніваюцца.

Два эксперыменты ў адной табліцы

Трымайце гэтую табліцу адкрытай падчас чытання. У ёй змяшчаюцца ўсе істотныя адрозненні паміж даследаваннямі.

Адрозніваюцца генетычныя асаблівасці, віды арганізмаў, шлях увядзення, час пачатку ўздзеяння і канчатковыя паказчыкі. Генатып — толькі адно з пяці адрозненняў, таму гэтыя дзве працы не могуць даказаць, што метыленавы сіні выбарачна дзейнічае на адзін з механізмаў БАС. Яны даказваюць нешта больш вузкае, але ўсё ж карыснае: выяўленае аднаўленне пры раннім непасрэдным уздзеянні ў простых мадэлях не перанеслася на ход захворвання ў млекакормячых пры працяглым пероральным увядзенні.

Станоўчы вынік: што паказала даследаванне на чарвяках і рыбах

У даследаванні на чарвяках і рыбах 2012 года у рухальных нейронах чарвякоў экспрэсавалі мутантны чалавечы TDP-43 або FUS, а ў эмбрыёны рыб уводзілі мутантную чалавечую мРНК. Гэта мадэлі пратэатаксічнасці. Яны ўзнаўляюць таксічны ўплыў мутантнага бялку на рух і форму нейронаў на працягу дзён, а не поўны ход БАС у дарослага чалавека на працягу гадоў.

Увядзенне рэчыва пачыналася вельмі рана. Чарвякі з моманту вылуплення раслі на агары з метыленавым сінім. Эмбрыёны рыб змяшчалі ў раствор прэпарату на ноч, пачынаючы праз 24 гадзіны пасля апладнення, а паводзіны правяралі прыкладна праз два дні. Паміж прэпаратам і нейронам не было такога гематаэнцэфалічнага бар’ера, як у млекакормячых, і ўзровень прэпарату ў плазме або мозгу не вымяралі.

У гэтых умовах эфекты былі вялікімі і ўзгодненымі. І 6, і 60 μM памяншалі ўзроставы параліч у чарвякоў з TDP-43 і FUS. На 12-ы дзень дарослага жыцця прыкладна 80 працэнтаў чарвякоў з TDP-43, якія не атрымлівалі рэчыва, былі паралізаваныя, у параўнанні з прыкладна 10 працэнтамі чарвякоў, якія атрымлівалі яго з моманту вылуплення. Сінаптычны тэст паказваў у тым жа кірунку: чарвякі з TDP-43 былі празмерна адчувальныя да альдыкарбу, прэпарату для даследавання нервова-мышачнай перадачы, а метыленавы сіні набліжаў рэакцыю да нормы. Колькасць адросткаў рухальных нейронаў з прыкметамі дэгенерацыі змяншалася, прычым найбольш выразны эфект назіраўся пры 60 μM. У рыб істотна паляпшалася плаванне ў адказ на дотык, а скарочаныя аксоны рухальных нейронаў пры 30 або 60 μM адрасталі ў бок нармальнай даўжыні, хоць аднаўленне было частковым, а не поўным.

Даныя пра акісляльны стрэс адпавядалі антыаксідантнай інтэрпрэтацыі. У мутантных чарвякоў і рыб былі павышаныя паказчыкі актыўных форм кіслароду, якія зніжаліся пры ўздзеянні рэчыва, а нармальныя чарвякі, якія атрымлівалі метыленавы сіні, выжывалі пры прааксідантным уздзеянні значна даўжэй за чарвякоў, якія яго не атрымлівалі. Але важныя два абмежаванні. Агульныя ўзроўні мутантных бялкоў TDP-43 і FUS не зніжаліся, а колькасць бялковых агрэгатаў у даследаванні непасрэдна не вызначалі. Таму яно паказвае функцыянальнае аднаўленне, але не даказвае выдалення агрэгатаў. Тым, хто сочыць за тым, як звычайна фармулююць акісляльна-аднаўленчыя і мітахандрыяльныя гіпотэзы, варта лічыць гэты механізм падмацаваным данымі, але не канчаткова ўстаноўленым.

Найбольш паказальнай дэталлю быў час пачатку ўздзеяння. Калі аўтары чакалі да 5-га дня дарослага жыцця, перш чым пачаць увядзенне рэчыва, частата паралічу на 12-ы дзень складала каля 55 працэнтаў замест прыкладна 10 працэнтаў пры ўвядзенні з моманту вылуплення. Той жа прэпарат, той жа чарвяк, тая ж мутацыя — значна меншы эфект. Ранняе прафілактычнае ўздзеянне забяспечвала вялікую частку назіранага станоўчага эфекту.

Адсутнасць значнага эфекту: што паказала даследаванне на мышах з SOD1

Даследаванне на мышах 2011 года ставіла больш складанае пытанне ў больш строгай сістэме. У кангенных мышэй з SOD1 G93A захворванне прагрэсіруе ад трэмару задніх канечнасцей праз парушэнне хады і страту рэфлексу пераварочвання ў нармальнае становішча да загадзя вызначанага тэрмінальнага канчатковага паказчыка. Увядзенне пачыналася да з’яўлення сімптомаў, на 45-ы дзень, і працягвалася штодня, а назіральнікі ацэньвалі неўралагічны стан па шкале ад 0 да 6. Гэта эксперымент, які ахоплівае ўвесь ход захворвання, таму ён бліжэйшы да таго, што важна для пацыента, чым любая крывая паралічу ў чарвяка.

Асноўныя вынікі не паказалі значнага эфекту. У цэлым захворванне пачыналася на 121-ы дзень у кантрольнай групе і на 124-ы дзень у групе метыленавага сіняга; розніца не была значнай. Выжывальнасць да канчатковай стадыі складала 167 дзён супраць 170 дзён, што таксама не было значнай розніцай. Некалькі другасных аналізаў паказалі вынікі на карысць увядзення рэчыва: у самак пачатак захворвання затрымліваўся прыкладна на 7 дзён, а жывёлы, якія атрымлівалі рэчыва, праводзілі крыху больш часу на лягчэйшых стадыях і менш — на цяжкіх. Улічваючы невялікія падгрупы паводле полу і шматлікія параўнанні стадый, гэтыя вынікі варта разглядаць як падставу для гіпотэз, а не як доказ. Колькасць нейронаў, агрэгацыю SOD1 і маркеры акісляльных або запаленчых працэсаў не вымяралі. Таму даследаванне таксама не можа паказаць, ці дасягнуў прэпарат сваіх мішэняў, але не спрацаваў, ці проста не ўзаемадзейнічаў з імі пры гэтай дозе. Правяралася толькі адна доза.

Самі аўтары адзначылі галоўнае абмежаванне, якое дзейнічае ў абодвух кірунках. Мадэль SOD1 G93A з вялікай колькасцю копій добра ўзнаўляе захворванне, выкліканае таксічнасцю SOD1, але захворванні, звязаныя з SOD1, складаюць невялікую частку сямейных выпадкаў БАС і біялагічна адрозніваюцца ад большасці спарадычных выпадкаў. Аўтары прапанавалі паўторна праверыць рэчывы-кандыдаты ў мадэлях млекакормячых на аснове TDP-43. З таго часу гэтая прапанова стала больш складанай, бо аўтары даследавання на чарвяках і рыбах адзначаюць, што асобнае даследаванне метыленавага сіняга на мышах з TDP-43 таксама не выявіла паляпшэння рухальных паказчыкаў. Такім чынам, злучэнне можа выглядаць моцным у адной сістэме TDP-43 і не даваць эфекту ў іншай сістэме TDP-43. Сістэма мае не меншае значэнне, чым ген.

Чаму паляпшэнне ў чарвякоў або рыб не можа пацвердзіць карысць для пацыентаў

Разглядайце кожную мадэль як адказ на асобнае пытанне.

Па-першае, адрозніваецца біялогія. TDP-43 і FUS — гэта бялкі, якія звязваюць нуклеінавыя кіслоты і маюць агульныя генетычныя ўзаемадзеянні ў гэтых простых сістэмах, тады як таксічнасць SOD1 рэалізуецца праз часткова адрозныя непасрэдныя механізмы. Прэпарат, які змякчае адзін від пратэатаксічнага стрэсу, не абавязкова змякчае іншы, а поспех пры празмернай экспрэсіі ў эмбрыёнаў не абавязкова прадказвае поспех пры павольнай нейрадэгенерацыі ў дарослых з запаленнем, удзелам гліі і пагаршэннем стану ўсяго арганізма.

Па-другое, адрозніваюцца ўмовы ўздзеяння. Пастаяннае знаходжанне ў асяроддзі з мікрамалярнымі канцэнтрацыямі — не тое ж самае, што пероральнае ўвядзенне. Паміж праглынутай дозай і рухальным нейронам спіннога мозгу стаяць усмоктванне ў кішэчніку, метабалізм першага праходжання, звязванне з бялкамі плазмы, пранікненне ў мозг і кліранс. Ні ў адным даследаванні не вымяралі ўзроўні прэпарату ў нервовай сістэме, таму ніводнае не дазваляе суаднесці свае канцэнтрацыі з канцэнтрацыямі ў іншым.

Па-трэцяе, адрозніваецца час пачатку ўздзеяння. Станоўчыя эфекты ў чарвякоў і рыб моцна залежалі ад пачатку ўвядзення да назапашвання паталагічных змен. У мышэй увядзенне таксама пачыналася да з’яўлення сімптомаў, што з’яўляецца моцным бокам даследавання, аднак у людзей лячэнне амаль заўсёды пачыналася б пасля з’яўлення сімптомаў, гэта значыць яшчэ пазней. Прафілактычны сігнал у двухдзённым тэсце на эмбрыёнах — адпраўны пункт для даследаванняў, а не мадэль клінічнага прымянення.

Па-чацвёртае, адрозніваюцца канчатковыя паказчыкі. Параліч на 12-ы дзень, адчувальнасць да альдыкарбу, даўжыня аксонаў у мікраметрах і адлегласць плавання — гэта непасрэдныя фенатыпічныя праявы. Пачатак захворвання і выжывальнасць у млекакормячых адлюстроўваюць сукупны ўплыў усіх кампенсаторных працэсаў і працэсаў, якія ўскладняюць стан арганізма. Прэпараты нярэдка змяняюць непасрэдныя паказчыкі, не змяняючы выжывальнасць. Менавіта таму ў даследаваннях на млекакормячых выкарыстоўваюць канчатковыя паказчыкі часу да падзеі.

Чытачы, якім патрэбны кантрольны спіс для ацэнкі наступнага гучнага загалоўка, могуць узяць яго з артыкула як чытаць даклінічныя даследаванні: высветліце від арганізма, трансген, дозу і шлях увядзення, ці вымяралі ўзроўні прэпарату, калі пачалося ўвядзенне адносна развіцця паталогіі, ці быў канчатковым паказчыкам кароткатэрміновы фенатып або ход захворвання і ці паўтарыўся эфект у другой лабараторыі. Каб праверыць, ці ператварыліся якія-небудзь з гэтых ранніх сігналаў у клінічныя даныя, варта звяртацца да шырэйшай доказнай базы па метыленавым сінім у людзей.

Што гэта азначае для пацыентаў і іх сем’яў

З гэтых прац не вынікае ніякага ўсталяванага пратаколу прымянення метыленавага сіняга пры БАС. Даследаванне са станоўчым вынікам падтрымлівае далейшае вывучэнне акісляльных і сінаптычных механізмаў у біялогіі TDP-43 і FUS. Даследаванне без значнага эфекту дае падставы не чакаць змены ходу захворвання пры працяглым пероральным увядзенні з такім узроўнем уздзеяння пры захворванні тыпу SOD1. Разам яны апісваюць неўзгодненасць вынікаў паміж мадэлямі, а не рэкамендацыю па лячэнні.

Бяспека заслугоўвае такой жа ўзважанай ацэнкі, як і эфектыўнасць. Даследаванні БАС на мышах нічога не кажуць пра бяспечныя дозы для людзей, а метыленавы сіні нясе рэальныя рызыкі гемолізу пры дэфіцыце G6PD і серотонінавай таксічнасці пры спалучэнні з серотонінергічнымі прэпаратамі. Падазрэнне на дэфіцыт G6PD, бягучы прыём антыдэпрэсантаў і любыя запланаваныя змены ў прыёме лекаў трэба абмяркоўваць з урачом. Гэтак жа, перш чым дзейнічаць на падставе гучных паведамленняў пра лабараторныя вынікі, варта разам з ім разгледзець агульныя даныя пра бяспеку метыленавага сіняга.

Галоўную выснову можна змясціць у адзін сказ. Метыленавы сіні пры раннім уздзеянні даваў выяўленае аднаўленне фенатыпічных паказчыкаў у чарвякоў і лічынак рыб з TDP-43 і FUS, але практычна не затрымліваў пачатак захворвання і не паляпшаў выжывальнасць у даследаванні на мышах з SOD1 пры працяглым пероральным увядзенні, таму сумленная інтэрпрэтацыя — гэта залежныя ад мадэлі доказы, якія не падтрымліваюць прымяненне ў пацыентаў.