Метыленавы сіні супраць біяплёнак: што вымяраюць лабараторныя даследаванні з актывацыяй святлом

Біяплёнка — гэта не навала клетак, якія плаваюць у вадкасці. Гэта структура: клеткі, прымацаваныя да паверхні і ўбудаваныя ў матрыкс з поліцукрыдаў, бялкоў і пазаклетачнай ДНК, які яны самі ўтвараюць, з градыентамі кіслароду і пажыўных рэчываў ад знешняй часткі да ўнутранай. Менавіта праз гэтую структуру злучэнне, якое забівае бактэрыі ў завісі за лічаныя хвіліны, можа не спрацаваць супраць тых жа арганізмаў, вырашчаных у выглядзе плёнкі. Любое сцвярджэнне пра метыленавы сіні і біяплёнкі трэба разглядаць з улікам гэтай структуры, бо матрыкс вызначае, колькі фарбавальніку дасягне клетак і колькі святла дасягне фарбавальніку.

Гэты агляд ахоплівае роўна тры крыніцы. Адна дае агульныя звесткі. Дзве апісваюць лабараторныя эксперыменты. Размежаванне гэтых роляў — аснова ўсяго падыходу, якая дазваляе пазбегнуць найбольш распаўсюджанай памылкі ў гэтай тэме: цытавання выніку ў лабараторнай пасудзіне так, нібыта ён сведчыць пра магчымасць лячэння інфекцыі ў чалавека.

Крыніца агульных звестак — пра хімію, а не пра знішчэнне мікраарганізмаў

Найстарэйшая з трох крыніц — апісальны агляд распрацоўкі фенатыязініевых фотасенсібілізатараў, апублікаваны ў 2005 годзе. Ён прасочвае шлях метыленавага сіняга ад фарбавальніку XIX стагоддзя да вядучага злучэння для фотадынамічнай тэрапіі раку, а пазней — для фотадынамічнай антымікробнай хіміятэрапіі. Яго ўклад — апісанне сувязі паміж структурай і актыўнасцю: метыліраванне храмафора павышае ліпафільнасць, выхад сінглетнага кіслароду і фотабактэрыцыдную актыўнасць, адначасова запавольваючы аднаўленне да менш актыўнай лейкаформы. Агляд таксама выразна называе праблему гэтай галіны. У большасці прац выкарыстоўвалі стандартныя камерцыйныя фарбавальнікі, а распрацоўцы вытворных надавалі параўнальна мала ўвагі.

Выкарыстоўвайце гэты агляд для разумення механізму: святло ўзбуджае фарбавальнік, трыплетны стан узаемадзейнічае з кіслародам праз перанос энергіі тыпу II з утварэннем сінглетнага кіслароду або праз перанос электрона тыпу I з утварэннем радыкалаў. Менавіта праз такое шматфактарнае ўздзеянне звычайныя механізмы ўстойлівасці слаба абараняюць ад фотадынамічнага знішчэння. Не спасылайцеся на гэты агляд як на крыніцу даных пра лагарыфмічнае зніжэнне. Ён яго не вымяраў. Больш шырокія фотахімічныя асновы гэтага механізму выкладзены ў падборцы даных пра фотадынамічную тэрапію, а правілы выбару даўжыні хвалі, якія вызначаюць, ці здольная канкрэтная лямпа запусціць гэты працэс, разглядаюцца ў матэрыяле пра тое, як метыленавы сіні паглынае чырвонае святло.

Два эксперыменты з біяплёнкамі, два розныя падыходы да ацэнкі вынікаў

Абедзве эксперыментальныя працы правяраюць фотадынамічнае дзеянне метыленавага сіняга на біяплёнкі ротавай поласці пры 660 nm, але амаль ва ўсім астатнім адрозніваюцца. Розныя супольнасці, розны ўзрост, розныя формы фарбавальніку, розныя дозы святла і, перадусім, розныя канчатковыя паказчыкі. Гэтае адрозненне — галоўная тэма артыкула і аснова арыгінальнай параўнальнай табліцы ніжэй.

Першая праца — даследаванне in vitro спелай шматвідавой паддзясневай біяплёнкі, апублікаванае ў 2024 годзе. Трыццаць тры віды сумесна вырошчвалі на полістыролавых штыфтах у прыладзе Calgary Biofilm Device з падачай пажыўнага асяроддзя ў анаэробных умовах; праз 72 гадзіны асяроддзе замянялі і працягвалі вырошчванне да намінальных 7 дзён. Апрацоўку праводзілі свабодным метыленавым сінім у канцэнтрацыі 0.01 працэнта і чырвоным святлодыёдам з даўжынёй хвалі 660 nm пры прыблізна 330 mW на квадратны cm на працягу 5 хвілін з адлегласці 2 mm, што ў выніку множання дае каля 99 J на квадратны cm. Дызайн — выразны фактарны эксперымент з чатырма групамі: кантроль без апрацоўкі, фарбавальнік без святла, святло без фарбавальніку і фарбавальнік са святлом.

Другая праца — даследаванне in vitro біяплёнкі ранніх каланізатараў ротавай поласці, апублікаванае ў 2021 годзе. Чатыры віды Streptococcus сумесна вырошчвалі на працягу 24 гадзін у 96-лункавых планшэтах з 1 працэнтам цукрозы. Фотасенсібілізатарам быў метыленавы сіні, звязаны з наначасціцамі бэта-цыкладэкстрыну, у канцэнтрацыі 4.65 мікрамоля на літр — форма дастаўкі, прызначаная для пераносу фарбавальніку праз бар’еры біяплёнкі. Абедзве крыніцы давалі чырвонае святло пры 660 nm з экспазіцыяй 90 секунд, але дозы рэзка адрозніваліся: 320 J на квадратны cm для лазернай групы і 8.1 J на квадратны cm для святлодыёднай. Кантрольныя групы ўключалі фарбавальнік без святла, толькі лазер, толькі святлодыёд, фізіялагічны раствор як адмоўны кантроль і 0.2 працэнта хлоргексідыну як эталон антымікробнага дзеяння.

Анаэробная супольнасць з 33 відаў узростам 7 дзён і плёнка ранніх каланізатараў з 4 відаў узростам 24 гадзіны — розныя сістэмы вымярэння. Прыведзеныя ніжэй значэнні нельга асерадняць.

Што насамрэч вымярала кожнае даследаванне

У даследаванні спелай біяплёнкі канчатковымі паказчыкамі былі метабалічная актыўнасць паводле аднаўлення TTC з вымярэннем пры 485 nm і колькасць бактэрый паводле ДНК-ДНК-гібрыдызацыі метадам checkerboard з зондамі для 33 відаў, з мяжой выяўлення каля 10,000 клетак. Не было ні падліку жыццяздольных мікраарганізмаў шляхам пасеву, ні вымярэння біямасы крышталічным фіялетавым, ні візуалізацыі жывых і мёртвых клетак, ні наступнага назірання за паўторным ростам. Адзін толькі святлодыёд зніжаў метабалічную актыўнасць прыкладна на 50 працэнтаў у параўнанні з групамі без святлодыёднага ўздзеяння, а фарбавальнік са святлодыёдам — прыкладна на 55 працэнтаў. Група толькі з фарбавальнікам статыстычна не адрознівалася ад кантролю без апрацоўкі. Паводле колькасці клетак, вызначанай на аснове ДНК, групы толькі з фарбавальнікам, толькі са святлодыёдам і з фарбавальнікам са святлодыёдам мелі значна ніжэйшыя паказчыкі за кантроль, без значных адрозненняў паміж гэтымі трыма групамі. Аўтары непасрэдна фармулююць вынік: апрацоўкі не разбурылі сфармаваную прымацаваную палімікробную біяплёнку, а спелая парадонтальная біяплёнка патрабуе механічнага разбурэння структуры, прычым фотадынамічнае ўздзеянне можа быць хіба што дадаткам.

У даследаванні ранніх каланізатараў канчатковым паказчыкам была колькасць жыццяздольных мікраарганізмаў, вырашчаных на селектыўных пажыўных асяроддзях, выражаная ў лагарыфмічнай шкале. Група з фарбавальнікам без святла не адрознівалася ад групы з фізіялагічным растворам. Абедзве фотаактываваныя групы — лазер з інкапсуляваным фарбавальнікам і святлодыёд з інкапсуляваным фарбавальнікам — зніжалі колькасць жыццяздольных мікраарганізмаў прыблізна да 4 log адносна адмоўнага кантролю: гэта зніжэнне ў 10,000 разоў, або на 99.99 працэнта, паводле гэтага паказчыка. Ніводная з іх статыстычна не адрознівалася ад хлоргексідыну. Значэнні для груп толькі са святлом і толькі з фарбавальнікам у цемры не былі пададзены як асобныя надзейныя лагарыфмічныя паказчыкі, таму дакладнае рэзюмэ абмяжоўваецца тым, што пацвярджае праца: фотаактываваны інкапсуляваны фарбавальнік выклікаў зніжэнне, фарбавальнік у цемры — не, а велічыня эфекту ў гэтай мадэлі маладой плёнкі адпавядала антысептычнаму эталону.

Ніводная праца не вымярала паўторны рост пасля апрацоўкі, рэшткавую біямасу або структуру матрыксу. Зніжэнне CFU нічога не кажа пра матрыкс, які застаўся. Спад метабалічнай актыўнасці нічога не кажа пра клеткі, што выжылі. Падлік паводле ДНК не дазваляе вызначыць, хто жывы.

Параўнанне метадаў аналізу і канчатковых паказчыкаў

Гэтая табліца — параўнальны матэрыял артыкула. Чытайце ўздоўж радка, каб убачыць, што даказвае кожнае даследаванне, і ўніз па слупку, каб зразумець, на якія пытанні ніводнае з іх не адказвае.

Варта падкрэсліць тры адрозненні. Па-першае, у спелай мадэлі група толькі са святлом тлумачыць амаль увесь метабалічны эфект, таму значэнне 55 працэнтаў не азначае знішчэння, апасродкаванага фарбавальнікам. Па-другое, у маладой мадэлі форма фарбавальніку ў цемры інертная, а эфект з’яўляецца толькі пры асвятленні, што з’яўляецца прыкметай фотаактывацыі. Па-трэцяе, падзенне колькасці клетак, вызначанай паводле ДНК, на 80 працэнтаў матэматычна адпавядала б прыкладна 0.7 log толькі тады, калі б пераменнай была колькасць жыццяздольных мікраарганізмаў. Але гэта не так, таму такі вынік ніколі нельга падаваць як лагарыфмічнае зніжэнне праз знішчэнне мікраарганізмаў. Дадатковыя звесткі пра стаматалагічныя біяплёнкі сабраны ў матэрыялах пра біяплёнкі ротавай поласці і стаматалагічныя даследаванні, а агульны падыход да размежавання мадэляў, шляхоў увядзення і канчатковых паказчыкаў у розных даследаваннях падрабязна апісаны ў даведніку па лабараторных метадах.

Чаму даследаванні біяплёнак патрабуюць уласных правілаў інтэрпрэтацыі

Чатыры пераменныя вызначаюць, ці мае вынік даследавання метыленавага сіняга на біяплёнцы значэнне за межамі ўласнага лабараторнага планшэта.

На першым месцы — узрост біяплёнкі і матрыкс. Старэйшыя плёнкі таўсцейшыя, маюць больш папярочных сувязяў, і фарбавальніку цяжэй пранікаць у іх. Аўтары працы 2021 года называюць пранікненне фарбавальніку і слабае распаўсюджванне святла праз арганізаваную біяплёнку галоўнымі абмежаваннямі. Стратэгіі выкарыстання носьбітаў, такія як інкапсуляцыя ў цыкладэкстрын, спрабуюць пераадолець менавіта гэтае абмежаванне, таму форма фарбавальніку — эксперыментальная пераменная, а не другарадная дэталь.

На другім месцы — разлік дозы. Значэнні энергетычнай экспазіцыі тут адрозніваюцца амаль у сорак разоў: ад 8.1 да 320 J на квадратны cm пры адной і той жа даўжыні хвалі, а апрамененасць — ад 90 mW да некалькіх W на квадратны cm. Аднолькавая даўжыня хвалі не азначае аднолькавай экспазіцыі, і ніводнае даследаванне не змяняе дозу дастаткова сістэматычна, каб пабудаваць крывую залежнасці.

На трэцім месцы — кантрольныя групы. Даследаванне без групы з фарбавальнікам у цемры не можа выключыць яго ўласную таксічнасць, а даследаванне без групы толькі са святлом не можа прыпісаць што-небудзь фотаактывацыі. Абедзве працы ўключаюць абодва кантролі, што з’яўляецца іх вартасцю. Праца са спелай плёнкай паказвае, чаму група толькі са святлом важная: без яе метабалічны вынік выглядаў бы як эфект фарбавальніку.

На чацвёртым месцы — канчатковыя паказчыкі. Жыццяздольнасць, метабалізм, колькасць паводле ДНК, біямаса, структура і паўторны рост — шэсць розных сцвярджэнняў. Ніводная з разгледжаных прац не вымярае больш за два такія паказчыкі. У прыватнасці, паўторны рост не ацэньваўся нідзе, таму захаванне эфекту не вымерана, а не прадэманстравана.

Чаго гэтыя працы не пацвярджаюць адносна лячэння інфекцыі

Ніводная з гэтых эксперыментальных сістэм не ўключае кровазвароту, імунных клетак, патоку сліны, абнаўлення вадкасці дзясневай баразны або механічнага выдалення адкладаў. Канцэнтрацыя фарбавальніку ў лунцы — не канцэнтрацыя ў тканках пасля якога-небудзь шляху ўвядзення чалавеку. Аднаразовае ўздзеянне працягласцю 5 хвілін або 90 секунд на маладую ці нават спелую лабараторную плёнку — не курс тэрапіі. Аўтары працы са спелай плёнкай самі кажуць пра гэта, разглядаючы фотадынамічнае ўздзеянне як магчымы дадатак да механічнага выдалення, а не як самастойны метад поўнага знішчэння.

Карэктнае рэзюмэ вузкае па ахопе і вытрымлівае крытычную праверку. Фотаактываваны метыленавы сіні можа прыгнятаць метабалізм і зніжаць колькасць клетак, вызначаную паводле ДНК, у спелай лабараторнай супольнасці ротавай поласці, не разбураючы яе; пры гэтым у такой эксперыментальнай сістэме большую частку метабалічнага эфекту забяспечвае само святло. Фотаактываваны фарбавальнік з цыкладэкстрынам у якасці носьбіту можа зніжаць колькасць жыццяздольных мікраарганізмаў на некалькі парадкаў у маладой лабараторнай стрэптакокавай плёнцы да ўзроўню, параўнальнага з хлоргексідынам у той жа мадэлі. Ці можна перанесці любое з гэтых назіранняў на інфекцыю ў чалавека, залежыць ад дастаўкі, доступу святла, кіслароду, анатоміі і клінічных канчатковых паказчыкаў, якія гэтыя эксперыменты ніколі не былі прызначаны вымяраць.