Даследаванні антымікробнага і супрацьгрыбковага дзеяння метыленавага сіняга: святло і цемра

Два чытачы бачаць словы «антымікробнае дзеянне метыленавага сіняга» і ўяўляюць розныя рэчы. Адзін уяўляе сінюю вадкасць, якая атручвае мікробы пры кантакце. Другі — працэдуру, падчас якой фарбавальнік разам з чырвоным святлом знішчае іх. У абодвух уяўленнях ёсць доля праўды. Ніводнае не дае поўнай карціны, а іх змешванне — галоўная прычына памылак у большасці сцвярджэнняў у інтэрнэце.

Гэтаму адрозненню і прысвечаны агляд. Пры дастатковай канцэнтрацыі метыленавы сіні мае ўмераную таксічнасць у цемры. Пры чырвоным святле ён становіцца фотасенсібілізатарам: паглынае фатон, пераходзіць у рэакцыйназдольны трыплетны стан і запускае акісляльныя рэакцыі, якія пашкоджваюць адразу шмат мішэняў. Гэты актываваны святлом рэжым мае ўласную назву — антымікробная фотадынамічная тэрапія — і ўласныя ўмовы. Адной канцэнтрацыі недастаткова, каб яго вызначыць. Вынік залежыць ад даўжыні хвалі, дозы святла, інкубацыі, кіслароду і арганізма.

Два механізмы знішчэння

Спачатку разгледзім дзеянне ў цемры. Метыленавы сіні — гэта станоўча зараджаны фенатыязініевы фарбавальнік. Ён звязваецца з абалонкамі мікробаў, у рознай ступені пранікае ў клеткі і ўдзельнічае ў акісляльна-аднаўленчых рэакцыях і ўзаемадзеяннях звязвання. Фатоны ў гэтым не ўдзельнічаюць. Знішчэнне адбываецца, але толькі пры канцэнтрацыях, якія моцна адрозніваюцца ў залежнасці ад арганізма, і механізм не зводзіцца да адной дакладна вызначанай мішэні.

Фотадынамічны механізм дадае святло. Чырвоныя фатоны ў дыяпазоне прыблізна ад 630 да 680 nm перакрываюцца з паласой паглынання фарбавальніка, прычым пік манамера знаходзіцца каля 664 nm. Паглынанне пераводзіць фарбавальнік у кароткажывучы сінглетны стан, а затым — у больш доўгажывучы трыплетны стан. Адтуль магчымыя дзве групы рэакцый. У рэакцыях тыпу I трыплет перадае электрон субстрату і запускае радыкальныя шляхі з удзелам супераксідных і гідраксільных часціц. У рэакцыях тыпу II ён перадае энергію непасрэдна кіслароду ў асноўным стане і ўтварае сінглетны кісларод. Абодва шляхі могуць працаваць адначасова, таму называць фарбавальнік выключна крыніцай сінглетнага кіслароду — празмернае спрашчэнне. Агляд сувязі структуры і актыўнасці фенатыязініевых фотасенсібілізатараў непасрэдна паказвае гэта: у роднасных фарбавальнікаў фотатаксічнасць для бактэрый не залежала толькі ад выхаду сінглетнага кіслароду, бо паглынанне клеткамі, лакалізацыя і аднаўленне да неактыўнай лейкаформы мелі такое ж значэнне, як і фотафізіка. Фотахімія, якая ляжыць у аснове правіла выбару даўжыні хвалі, тлумачыцца ў спадарожным аглядзе фарбавальніка ў спалучэнні з чырвоным святлом.

Сінглетны кісларод адыгрывае цэнтральную ролю ў адной карыснай уласцівасці. Ён рэагуе адначасова з многімі біямалекуламі, таму атака шматфактарная, а не накіраваная на адзін фермент ці бялок звязвання. У асноватворным апісанні фотадынамічнай антымікробнай хіміятэрапіі гэта было прадстаўлена як прычына таго, што звычайныя профілі ўстойлівасці маюць невялікае значэнне: дадатковы пеніцылін-звязвальны бялок або мутаваная тапаізамераза не блакуюць рэзкі ўсплёск актыўных формаў кіслароду. Гэтая логіка пацвердзілася пры выпрабаваннях супраць метыцылін-рэзістэнтнага Staphylococcus aureus і ванкаміцын-рэзістэнтных энтэракокаў, як паказвае табліца ніжэй. Гэта не азначае, што ўстойлівасць немагчымая, толькі тое, што яна дзейнічае інакш. Эфлюксныя помпы і антыаксідантныя ахоўныя механізмы ўсё яшчэ могуць змяняць патрэбную дозу, асабліва ў грыбоў.

Табліца арганізмаў і мадэляў даследавання

Гэтая табліца — асноўны матэрыял артыкула. Кожнае значэнне прывязана да канкрэтнага пратакола: той самы фарбавальнік, але іншая доза святла або інкубацыя — і іншая лічба. Не лічыце MBC, MLC і MIC узаемазаменнымі. MBC і MLC тут азначаюць адсутнасць выжылых арганізмаў пры перасеве, а MIC — падаўленне росту. Умовы асвятлення прыведзены для кожнага радка.

Арганізм і мадэль	Вынік у цемры	Вынік пры святле	Умовы
S. aureus NCTC 6571, планктонная суспензія	MBC 5 uM	MBC 5 uM	Табліца з агляду, белае святло 12 J на cm2
S. aureus NCTC 6571, планктонная суспензія	MLC 2.5 uM	MLC 1 uM	Пратакол першаснага даследавання 1997 года, 1.7 mW на cm2 на працягу 1 гадзіны, каля 6.3 J на cm2, інокулюм каля 10^6 CFU на mL, паводле арыгінальнага даследавання фотабактэрыцыднага дзеяння фенатыязініевых фарбавальнікаў
MRSA EMRSA-15, планктонная культура	MBC 80 uM	MBC 20 uM	Табліца з агляду, каля 12 J на cm2, чатырохразовае павышэнне адчувальнасці
MRSA EMRSA-16, планктонная культура	MBC 40 uM	MBC 10 uM	Той самы пратакол, што і вышэй
E. coli NCTC 9001, планктонная культура	MBC 500 uM	MBC 100 uM	Той самы пратакол, пяціразовае павышэнне адчувальнасці
P. aeruginosa NCTC 10622, планктонная культура	MBC 500 uM	MBC 25 uM	Той самы пратакол, дваццаціразовае павышэнне адчувальнасці
E. faecalis NCTC 775, планктонная культура	MLC 100 uM	MLC 100 uM	Пратакол 1997 года пры 6.3 J на cm2, без паляпшэння для гэтага штама і дозы
Ванкаміцын-рэзістэнтны E. faecium, планктонная культура	MBC 400 uM	MBC 400 uM	Табліца з агляду, без паляпшэння з зыходным фарбавальнікам, тады як больш гідрафобныя метыляваныя вытворныя давалі паляпшэнне, паводле даследавання ванкаміцын-рэзістэнтных энтэракокаў
Candida albicans, планктонная культура	MIC вышэй за 12.79 ug на mL	MIC 12.79, 6.39 і 1.59 ug на mL пры 5, 10 і 15 J на cm2	Папярэдняя інкубацыя ў цемры на працягу 30 хвілін, чырвоны LED ад 600 да 650 nm з пікам пры 635 nm, паводле даследавання залежнасці супрацьгрыбковага фотадынамічнага дзеяння метыленавага сіняга ад дозы
C. albicans YEM14 у параўнанні са штамам з павышанай экспрэсіяй эфлюксных помпаў, знішчэнне паводле CFU	Не прымяняецца	Зніжэнне прыкладна на 5 log у зыходнага штама, амаль нулявое знішчэнне ў штама з павышанай экспрэсіяй CDR1/CDR2	100 uM фарбавальніка, інкубацыя на працягу 30 хвілін, 660 nm пры 60 J на cm2, паводле даследавання ўплыву эфлюксных помпаў на фотазнішчэнне метыленавым сінім
Гіфы Trichophyton rubrum у параўнанні са спорамі	Не прымяняецца	MIC для гіфаў каля 6.3 ug на mL, для спораў каля 2.0 ug на mL; для поўнага блакавання CFU патрабавалася 5 ug на mL плюс 100 J на cm2 для гіфаў супраць 1.25 ug на mL плюс 40 J на cm2 для спораў	Фотадынамічны пратакол пры 635 nm, паводле даследавання адчувальнасці дэрматафітаў на розных стадыях развіцця
Спелая паддзясневая біяплёнка з 33 відаў, прылада Calgary, дзень 6	Толькі MB: зніжэнне агульнай колькасці больш чым на 80 працэнтаў	MB плюс LED 660 nm: зніжэнне метабалічнай актыўнасці прыкладна на 55 працэнтаў, без маштабнай перабудовы супольнасці	0.01 працэнта фарбавальніка (100 ug на mL), 660 nm пры каля 330 mW на cm2 на працягу 5 хвілін, анаэробны рост, паводле даследавання шматвідавой біяплёнкі ротавай поласці in vitro

Вылучаюцца тры заканамернасці. Па-першае, грамстаноўчыя стафілакокі гінуць пры нізкіх мікрамалярных канцэнтрацыях, тады як грамадмоўным палачкам у цемры трэба прыкладна ў сто разоў больш фарбавальніка, бо іх вонкавая мембрана абмяжоўвае пранікненне. Святло скарачае гэты разрыў, але не ліквідуе яго. Па-другое, супрацьгрыбковае дзеянне метыленавага сіняга рэальнае, але залежыць ад умоў: знішчэнне Candida метыленавым сінім рэзка ўзмацняецца з павелічэннем дозы святла, а адна змена фенатыпу, напрыклад павышаная экспрэсія эфлюксных помпаў, можа пры той самай дозе ліквідаваць эфект зніжэння на 5 log. Па-трэцяе, спелая біяплёнка паводзіць сябе інакш, чым суспензіі, і менавіта ў гэтым кантэксце трэба разглядаць радок пра біяплёнку ротавай поласці.

Бактэрыі: дзе святло дапамагае найбольш, а дзе не дапамагае

Стафілакокі — прыклад адчувальных арганізмаў. Нават значэнні для эпідэмічных MRSA ў агляднай табліцы пасля прымянення святла знаходзяцца на ўзроўні паказчыкаў ванкаміцыну, узятага для параўнання, або ніжэй за іх, а дыметыляваныя вытворныя давалі яшчэ лепшыя вынікі, бо метыляванне павышала ліпафільнасць і выхад сінглетнага кіслароду, адначасова перашкаджаючы аднаўленню да лейкаформы. Гэтая хімічная дэталь важная: яна паказвае, што знішчэнне — вынік дастаўкі разам з фотафізікай, а не толькі фотафізікі.

Грамадмоўныя арганізмы ілюструюць ролю дастаўкі. Для Pseudomonas патрабавалася 500 uM у цемры і 25 uM пры святле — дваццаціразовае паляпшэнне, але значэнне пры святле ўсё яшчэ значна вышэйшае за дыяпазон для стафілакокаў. Катыённы зарад дапамагае фарбавальніку наблізіцца да вонкавай мембраны, але пранікненне застаецца абмежавальным фактарам. Склад прэпарату, час інкубацыі і выбар вытворнай змяняюць гэтыя паказчыкі мацней, чым паўторнае прымяненне таго самага фарбавальніка ў большай дозе.

Энтэракокі даюць падставу для асцярожнасці. У старых пратаколах E. faecalis увогуле не паказваў перавагі святла, а для ванкаміцын-рэзістэнтнага E. faecium патрабавалася іншая малекула, а не больш святла. Той, хто прыводзіць адно значэнне MBC метыленавага сіняга як універсальную антыбактэрыяльную канстанту, няправільна разумее літаратуру. Такой канстанты няма. Ёсць толькі значэнні, спецыфічныя для штама, асяроддзя, інокулюму, інкубацыі, даўжыні хвалі і энергетычнай экспазіцыі. Як чытаць гэтыя значэнні без самападману, разглядаецца ў кіраўніцтве па інтэрпрэтацыі крывых знішчэння.

Грыбы: адчувальныя, але вынік вызначаюць стадыя і помпы

Клетачныя сценкі грыбоў з глюканаў, мананаў і хіціну ствараюць іншую праблему пранікнення, чым у бактэрый, а таксама грыбы маюць актыўныя ахоўныя механізмы. Прыведзены вышэй вынік эфлюксу ў Candida — найярчэйшы прыклад: той самы фарбавальнік, тое самае святло, тое самае асяроддзе, але штам з павышанай экспрэсіяй выжыў, тады як зыходны страціў каля 99.999 працэнта калоніяўтваральных адзінак. Дэрматафіты дадаюць залежнасць ад стадыі развіцця. Споры гінуць значна лягчэй, чым гіфы, таму пратакол, які ліквідуе споры, пры той самай дозе ўсё яшчэ можа пакінуць фрагменты гіфаў жыццяздольнымі.

Таму паведамленні пра супрацьгрыбковае дзеянне метыленавага сіняга патрабуюць такой жа дакладнасці ў задаванні параметраў святла, як і даследаванні бактэрый. Клінічныя фотадынамічныя даследаванні пазногцяў і скуры спалучалі фарбавальнік у канцэнтрацыі ад 1 да 2 працэнтаў з чырвоным святлом з вымеранымі параметрамі пры вызначанай энергетычнай экспазіцыі і наступным назіранні, прычым клінічны выгляд ацэньваўся асобна ад мікалагічнага ачышчэння. Гэтыя выпрабаванні разгледжаны ў аглядзе доказаў фотадынамічнага ўздзеяння на грыбковыя паражэнні пазногцяў і скуры. Нанясенне разведзенага фарбавальніка на ачаг паражэння пры пакаёвым асвятленні паўтарае колер, але не саму працэдуру.

Праверка на біяплёнцы: мадэль ротавай поласці з 33 відаў

Даследаванне шматвідавой біяплёнкі ротавай поласці 2024 года заслугоўвае ўвагі, бо правярае складаны выпадак, а не просты. Трыццаць тры віды ротавай поласці, у тым ліку Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium і стрэптакокі ротавай поласці, раслі анаэробна і на дзень 6 утварылі спелую біяплёнку. Апрацоўка складалася з фарбавальніка ў канцэнтрацыі 0.01 працэнта і LED 660 nm на працягу 5 хвілін пры высокай шчыльнасці магутнасці выпраменьвання. І фарбавальнік асобна, і святло асобна істотна зніжалі агульную колькасць, а іх спалучэнне зніжала метабалічную актыўнасць прыкладна напалову, аднак супольнасць не перабудоўвалася і біяплёнка не была стэрылізаваная.

Гэта сапраўдны эфект з выразна акрэсленай мяжой. Ён падтрымлівае фотадынамічную апрацоўку як мясцовае дапаможнае ўздзеянне ў ачышчанай кішэні, а не як паласканне, якое само па сабе лечыць дыягнаставаны парадантыт. Гэта падводзіць нас да агульнага разрыву.

Чаму лабараторнае знішчэнне не роўнае лячэнню

Пры вызначэнні MBC для планктоннай культуры аднастайныя клеткі падвяргаюцца ўздзеянню раўнамерна размеркаванага фарбавальніка і святла ў асяроддзі з кіслародам. У ачагу паражэння нічога з гэтага няма. Матрыкс запавольвае пранікненне, станы, падобныя да стану персістараў, дазваляюць пераносіць акісленне, кроў і эксудат паглынаюць святло, геаметрыя тканак пакідае зацененыя ўчасткі, а гіпаксічныя кішэні аслабляюць рэакцыі тыпу II, бо для ўтварэння сінглетнага кіслароду паводле вызначэння патрэбны малекулярны кісларод. Змешаныя інфекцыі дадаюць віды, якія адрозніваюцца па паглынанні і адчувальнасці, таму значэнне для аднаго эталоннага штама не можа прадстаўляць увесь ачаг.

Прыклад ротавай поласці робіць гэты разрыў канкрэтным. Зніжэнне колькасці Porphyromonas або стрэптакокаў у лабараторным посудзе ці падаўленне культываванай біяплёнкі напалову не даказвае, што сіняе паласканне лечыць парадантыт, вылечвае эндадантычную інфекцыю або ліквідуе бактэрыямію. Клінічная параданталагічная дапамога залежыць ад механічнага разбурэння і выдалення біяплёнкі разам з улікам анатоміі кішэні, а ўздзеянне святлом вывучаецца як лакалізаваны дапаможны метад. Канцэнтрацыя фарбавальніка, якая знішчае бактэрыі ў лунцы, не мае фіксаванай сувязі з канцэнтрацыяй, якая дасягае бактэрый пад краем дзясны, а пакаёвае святло — не доза выпраменьвання 660 nm. Пытанні дазавання, бяспекі і межаў узаемадзеянняў пры любым ужыванні ў ротавай поласці належыць разглядаць з клініцыстам, як апісана ў даведніку па бяспецы і ўзаемадзеяннях.

Чаго гэтыя доказы не азначаюць

Гэта не сцвярджэнне пра бытавы дэзінфекцыйны сродак. У табліцах бактэрыцыднага дзеяння выкарыстоўваюцца вызначаныя штамы, асяроддзі, час кантакту, спектры і энергетычныя экспазіцыі. Яны нічога не кажуць пра кухонныя паверхні, неабходны час кантакту пры арганічным забруджванні або нарматыўныя стандарты дэзінфекцыі.

Гэта таксама не замена сістэмным антыбіётыкам. Звычайнае фотадынамічнае дзеянне патрабуе, каб фарбавальнік, паглынутае святло і кісларод знаходзіліся ў адным месцы ў адзін час. Святло не дасягае глыбокіх або рассеяных ачагоў так, як прыняты ўнутр прэпарат трапляе ў кроў. У літаратуры гэты падыход разглядаецца для даступных мясцовых інфекцый або як дапаможны метад — менавіта так, як Уэйнрайт з самага пачатку апісваў мясцовую дэзінфекцыю.

Абгрунтаваная выснова вузейшая, але ўсё яшчэ цікавая. Метыленавы сіні мае ўмераную антымікробную актыўнасць у цемры, а чырвонае святло раскрывае значна мацнейшы фотадынамічны эфект для многіх бактэрый і грыбоў. Адрозненні паміж святлом і цемрай могуць быць вялікімі: напрыклад, ад 500 да 25 uM для Pseudomonas і ад 80 да 20 uM для эпідэмічных MRSA, разам з паказальнымі няўдачамі ў энтэракокаў і Candida з актыўнымі эфлюкснымі механізмамі. Перанос вынікаў на практыку залежыць ад дастаўкі, фізіялогіі біяплёнкі і кіслароду не менш, чым ад намінальнай канцэнтрацыі фарбавальніка. Калі захоўваць гэтыя ўмовы ў полі зроку, лічбы нешта азначаюць. Калі адкінуць іх, лічбы не азначаюць нічога.