Аналізы дрожджаў з метыленавым сінім: падлік жывых клетак і вымярэнне часу дыхання

На лабараторным стале стаяць дзве прабіркі. Абедзве сінія. У адной сінія клеткі пад мікраскопам азначаюць мёртвыя дрожджы. У другой пераход змесціва прабіркі ад сіняга да бясколернага азначае, што дрожджы жывыя і дыхаюць. Той самы фарбавальнік, процілеглая інтэрпрэтацыя. Калі пераблытаць гэтыя два аналізы, усе высновы будуць адваротнымі.

Гэтаму адрозненню прысвечаны ўвесь артыкул. Метыленавы сіні — акісляльна-аднаўленчы фарбавальнік: у акісленай форме ён сіні, у адноўленай — бясколерны лейкаметыленавы сіні. Пры падліку жыццяздольных клетак гэтая хімічная ўласцівасць выкарыстоўваецца для кароткага назірання пад мікраскопам. У эксперыменце з дыханнем яна выкарыстоўваецца ў рэакцыі, якая ідзе ва ўсім аб’ёме сумесі, з вымярэннем часу. Кожны аналіз патрабуе свайго пратакола, сваіх кантрольных узораў і сваёй крытычнай ацэнкі.

Падлік жыццяздольных клетак: кароткае афарбоўванне і неадкладная ацэнка

Пратакол, які выкарыстоўваецца ў піваварстве, — найбольш стандартызаваны варыянт. Прыгатуйце 0.01% w/v раствор метыленавага сіняга ў 2% растворы цытрату натрыю, змяшайце яго ў суадносінах 1:1 з суспензіяй дрожджаў і даследуйце сумесь праз кароткі фіксаваны прамежак часу. У апублікаваных крыніцах гэты прамежак вар’іруецца ад 1 да 2 хвілін у даведніку Brewing Science Institute да прыкладна 5 хвілін у даследчых пратаколах, а метад OIV для мікрабіялогіі віна патрабуе правесці даследаванне на працягу 10 хвілін. Канчатковая канцэнтрацыя фарбавальніка ў сумесі для падліку складае каля 0.005%. Запоўніце ўдасканаленую камеру Нойбаўэра і пры павелічэнні каля 400x класіфікуйце цёмна-сінія клеткі як нежыццяздольныя, а неафарбаваныя — як жыццяздольныя. У метадзе OIV светла-сінія клеткі лічацца жывымі, што ўжо паказвае на праблему суб’ектыўнасці, разгледжаную ніжэй.

Канцэнтрацыю клетак вызначаюць з геаметрыі камеры. Калі падлічаны ўвесь цэнтральны квадрат са стараной 1 mm, колькасць клетак на mL роўная N, памножанаму на каэфіцыент развядзення і на 10^4, дзе N — колькасць клетак у гэтай вобласці, як апісана ў метадах ASBC для дрожджаў. Жыццяздольнасць вылічыць прасцей: колькасць неафарбаваных клетак падзяліць на агульную колькасць клетак і памножыць на 100. Для ацэнкі жыццяздольнасці падлічыце каля 400 клетак, прытрымліваючыся параўнальнага даследавання FEMS у піваварстве і практыкі OIV. Паслядоўна выкарыстоўвайце адно правіла ўліку клетак на межах: напрыклад, улічвайце клеткі на ніжняй і левай лініях сеткі і не ўлічвайце клеткі на верхняй і правай.

Правіла ўліку пупышак трэба вызначыць да пачатку падліку. Паводле распаўсюджанага правіла, пупышку лічаць асобнай клеткай, калі яна дасягае прыкладна паловы памеру мацярынскай клеткі; меншыя пупышкі ўлічваюць разам з мацярынскай клеткай. Якое б правіла вы ні выбралі, прымяняйце яго да кожнага квадрата і запішыце ў бланку, каб наступны выканаўца мог яго паўтарыць.

Бланк падліку (раздрукуйце)

Гэты бланк — арыгінальны матэрыял для гэтага артыкула. Перапішыце яго ў лабараторны сшытак або раздрукуйце па адным для кожнага ўзору.

Жыццяздольнасць (%) = 100 x неафарбаваныя / (неафарбаваныя + цёмна-сінія). Агульная колькасць клетак на mL = N x каэфіцыент развядзення x 10^4, дзе N — колькасць клетак у вызначанай вобласці камеры. Запішыце час афарбоўвання побач з вынікам, бо паказчык жыццяздольнасці без указання часу немагчыма ўзнавіць.

Чаму паказчыкі жыццяздольнасці змяняюцца

Час — першы фактар скажэння, і ён дзейнічае ў абодва бакі. Метабалічна актыўныя клеткі аднаўляюць фарбавальнік, таму пры ранняй ацэнцы можна ўбачыць жывыя клеткі да завяршэння аднаўлення і памылкова класіфікаваць іх як мёртвыя. Але працяглае ўздзеянне само па сабе таксічнае і прыводзіць да з’яўлення сапраўды пашкоджаных сініх клетак, ствараючы ілжывае ўяўленне пра зыходную долю мёртвых клетак. Таму навучальны лабараторны пратакол патрабуе праводзіць ацэнку на працягу 5 хвілін, як апісана ў навучальным пратаколе па дрожджах Вісконсінскага ўніверсітэта. Карэктна казаць, што ацэнка з метыленавым сінім залежыць ад часу, таму трэба выбраць адзін кароткі прамежак і захоўваць яго нязменным для ўсіх узораў у серыі.

Узоры з нізкай жыццяздольнасцю маюць другую крыніцу скажэння. Стандартызаваны метад папярэджвае, што метыленавы сіні можа завышаць сапраўдную жыццяздольнасць пры значэннях ніжэй за прыкладна 80%, бо клеткі, якія яшчэ аднаўляюць фарбавальнік, не абавязкова захоўваюць здольнасць да размнажэння. Літаратура па піваварстве апісвае такую ж ненадзейнасць пры істотным зніжэнні жыццяздольнасці. Выкарыстоўвайце метыленавы сіні як сродак хуткай прыблізнай ацэнкі, а важныя рашэнні пры нізкай жыццяздольнасці, напрыклад паўторнае ўнясенне культуры, пацвярджайце падлікам калоній на пажыўным асяроддзі або дадатковым афарбоўваннем.

Уплыў матрыцы ўзору — трэці фактар. Метад OIV праводзяць пры pH каля 4.6; ён папярэджвае, што ўзоры з нізкім pH і высокай буфернай ёмістасцю перашкаджаюць правільным паводзінам фарбавальніка, а таксама не рэкамендуе гэты аналіз пры ўтрыманні цукру вышэй за 100 g/L, калі клеткі выглядаюць светла-сінімі і ўводзяць у зман. Эксперыментальнае параўнанне pH пры афарбоўванні выявіла істотныя змены адчувальнасці ў даследаваным дыяпазоне, што ўзгадняецца з даследаваннем залежнасці метаду з метыленавым сінім ад pH. Староннія часціцы — асобная пастка: афарбаваныя часціцы ў забруджаных заторах нагадваюць мёртвыя клеткі і павялічваюць разыходжанні паміж выканаўцамі.

Гэтая варыябельнасць пацверджана колькасна, а не толькі асобнымі назіраннямі. У шасцімесячным выпрабаванні на бровары, апісаным у параўнальным даследаванні дрожджаў FEMS, стандартнае адхіленне паўторных вымярэнняў з метыленавым сінім у сярэднім складала 6.1% супраць 0.2% для праточнай цытаметрыі з аксанолам, а вынікі двух выканаўцаў для аднаго ўзору адрозніваліся да 13 працэнтных пунктаў. Колькаснае параўнанне метадаў ацэнкі жыццяздольнасці 2023 года выявіла істотна большую дакладнасць флуарэсцэнтнай мікраскапіі і праточнай цытаметрыі, адначасова паказаўшы, што выніковасць залежыць ад віду і матрыцы ўзору. Класічнае апісанне метаду ў працы Пэйнтынга і Кірсапа (PMID 24430080) застаецца асноўнай крыніцай, а больш шырокі агляд аналізаў жыццяздольнасці і фізіялагічнай актыўнасці дрожджаў (PMID 25154541) адносіць метыленавы сіні да дадатковых, а не канчатковых тэстаў. Трыпанавая сінь тут не з’яўляецца аўтаматычна лепшым выбарам: яна паказвае страту цэласнасці мембраны, а метыленавы сіні — паглынанне фарбавальніка разам з аднаўленчай актыўнасцю, таму клеткі ў стане стрэсу могуць класіфікавацца па-рознаму пры выкарыстанні гэтых двух фарбавальнікаў.

Эксперымент з дыханнем: вымерайце час знікнення сіняга колеру

Другі аналіз не патрабуе мікраскопа. Дрожджы, глюкозу і разведзены метыленавы сіні змяшчаюць у закрытую прабірку і вымяраюць час да знікнення сіняга колеру. У працэсе метабалізму клеткі ўтвараюць аднаўленчыя эквіваленты, якія пераводзяць сіні фарбавальнік у бясколерную форму, а раствораны кісларод зноў яго акісляе. Калі клеткі зніжаюць утрыманне кіслароду, аднаўленне пачынае пераважаць і змесціва прабіркі абясколерваецца. Такім чынам, канчатковая кропка адлюстроўвае баланс паміж дыханнем, канцэнтрацыяй фарбавальніка і даступнасцю кіслароду; вынік трэба падаваць як час аднаўлення або абясколервання метыленавага сіняга, а не як непасрэдную хуткасць спажывання малекулярнага кіслароду.

Выкарыстоўвайце значна больш разведзены фарбавальнік, чым пры ацэнцы жыццяздольнасці, каб вымяраны час быў у зручным дыяпазоне. Дапаможнік AQA па абавязковых практычных работах узроўню A level добра стандартызуе працэдуру: 1 g глюкозы на 100 mL вады, нагрэтай прыкладна да 30 C, 5 g сухіх дрожджаў, дададзеных непасрэдна перад выкарыстаннем, і рабочы раствор фарбавальніка з канцэнтрацыяй каля 0.001%, прыгатаваны развядзеннем 0.1 mL 1% зыходнага раствору да 100 mL. Змяшайце 2 mL суспензіі дрожджаў з глюкозай і 2 mL рабочага раствору фарбавальніка, дачакайцеся выраўноўвання тэмпературы да тэмпературы выпрабавання, адзін раз узбоўтайце на працягу 10 секунд, запусціце таймер і больш не ўзбоўтвайце. Узбоўтванне зноў уводзіць кісларод і вяртае сіні колер — гэта найбуйнейшы працэдурны артэфакт. AQA адзначае, што сумесь звычайна павінна абясколервацца прыкладна за 5 хвілін пры 35 C; сярэднія значэнні ў выпрабаванні складалі 275 s пры 20 C, 128 s пры 35 C і 145 s пры 45 C. Гэта прыклады для адной эксперыментальнай схемы, а не ўніверсальныя арыенціры. Колькасная сувязь паміж хуткасцю аднаўлення і метабалічна актыўнымі дрожджамі ў кантраляваных умовах пацвярджаецца спецыяльнымі даследаваннямі аднаўлення, у тым ліку працай з індэксам PMID 25773544 і даследаваннем механізму ў Yeast (2014).

Дэманстрацыя дынамікі ў часе (арыгінальны матэрыял)

Табліца ніжэй — арыгінальная дэманстрацыя, падрыхтаваная для гэтага артыкула з выкарыстаннем апісанай вышэй схемы AQA: 2 mL сумесі дрожджаў з глюкозай плюс 2 mL рабочага раствору фарбавальніка з канцэнтрацыяй каля 0.001%, адно ўзбоўтванне на працягу 10 секунд, затым інкубацыя без узбоўтвання. Запісы ўяўляюць сабой прыклады паказанняў у фармаце, якім павінна карыстацца група навучэнцаў; індэкс хуткасці вызначаны як 1, падзеленая на час абясколервання ў секундах. Правядзіце дослед з такімі ж прабіркамі і замяніце гэтыя запісы вымеранымі значэннямі.

Пабудуйце графік залежнасці індэкса хуткасці ад тэмпературы для прабірак A, B і C. Крывая спачатку падымаецца, затым выходзіць на плато або зніжаецца — гэта чаканая карціна працэсу, абумоўленага ферментамі, а не прамая лінія. Прабіркі D, E і F не з’яўляюцца кропкамі даных на гэтай крывой. Гэта кантрольныя ўзоры, якія дазваляюць яе інтэрпрэтаваць.

Кантрольныя ўзоры, якія робяць кожны аналіз змястоўным

Кожная серыя эксперыментаў з дыханнем патрабуе трох спадарожных кантрольных узораў. Кіпячоныя або забітыя дрожджы з глюкозай і фарбавальнікам павінны заставацца сінімі, пацвярджаючы, што хуткае аднаўленне залежыць ад метабалізму жывых клетак. Жывыя дрожджы з фарбавальнікам без дададзенай глюкозы — гэта кантроль субстрату, але ўсё роўна варта чакаць павольнага абясколервання, бо дрожджы расходуюць унутраныя запасы. Глюкоза з фарбавальнікам без дрожджаў — хімічны халасты ўзор; ён неабходны, бо ў шчолачным асяроддзі глюкоза можа аднаўляць метыленавы сіні без усякіх клетак.

Падлік жыццяздольных клетак патрабуе іншага кантролю: нязменнасці працэдуры. Той самы зыходны раствор фарбавальніка, тыя самыя суадносіны змешвання, той самы час афарбоўвання, тая самая вобласць камеры, тыя самыя правілы ўліку пупышак і клетак на межах; па магчымасці — сляпы падлік. Калі вынікі двух выканаўцаў адрозніваюцца на дзесяць пунктаў, бланк звычайна выяўляе прычыну: розны час, розны парог аднясення да сініх клетак або розныя правілы ўліку пупышак. Прыёмы падрыхтоўкі і назірання афарбаваных клетак звязаны з метадамі простага афарбоўвання бактэрый, а шырэйшы агляд таго, што фарбавальнік выяўляе ў розных узорах, змешчаны ў атласе афарбоўвання для мікраскапіі. Фізічныя асновы колькаснай ацэнкі інтэнсіўнасці сіняга колеру раскрываюць рэферэнтныя даныя паглынання з указаннем умоў: яны тлумачаць, чаму кожны каэфіцыент павінен суправаджацца звесткамі пра растваральнік, pH і канцэнтрацыю.

Выбірайце аналіз паводле пытання. Колькі клетак жывыя цяпер — гэта пытанне падліку, на якое адказваюць з дапамогай мікраскопа і бланка. Наколькі актыўна дыхае гэтая культура — гэта пытанне кінетыкі, на якое адказваюць з дапамогай секундамера і прабірак з кантраляванымі ўмовамі. Метыленавы сіні служыць абедзвюм мэтам, але ніколі не ў адной прабірцы адначасова.