Метыленавы сіні для афарбоўвання ДНК і РНК: прымяненне ў гелях і на мембранах

Студэнт праводзіць электрафарэз у агарозным гелі, афарбоўвае яго метыленавым сінім і нічога не бачыць там, дзе чакалася яркая паласа. За суседнім працоўным месцам даследчык-постдок афарбоўвае мембрану для нозерн-блотынгу фарбавальнікам з такой самай сіняй бутэлькі і за тры хвіліны атрымлівае выразныя рыбасомныя палосы. Студэнт робіць выснову, што электрафарэз не ўдаўся. Але ён удаўся. Задачы былі розныя, і адзін і той жа фарбавальнік вырашае іх з рознай адчувальнасцю, розным фонам і рознымі правіламі для наступных этапаў.

Афарбоўванне ДНК і РНК метыленавым сінім мае агульную хімічную аснову, але розныя мэты. У гелі фарбавальнік паказвае, колькі нуклеінавай кіслаты знаходзіцца ўнутры порыстай матрыцы. На мембране ён паказвае, ці ўдалося перанясенне і ці раўнамерна былі загружаны дарожкі. Калі гэтае адрозненне зразумелае, пратаколы, межы выяўлення і абмежаванні сумяшчальнасці становяцца лагічнымі.

Кароткі адказ

Метыленавы сіні — плоскі катыённы фарбавальнік, які звязваецца з нуклеінавымі кіслотамі некавалентна і зварачальна праз спалучэнне электрастатычнага прыцягнення да фасфатных груп, інтэркаляцыі паміж парамі асноў і звязвання ў малой баразёнцы. Менавіта зварачальнасць тут і важная. Палосы можна афарбаваць і разгледзець у бачным святле, зафіксаваць выяву, а затым абясколерыць або ачысціць матэрыял для кланавання, гібрыдызацыі ці паўторнага даследавання зондам.

Для афарбоўвання двухланцуговай ДНК метыленавым сінім у агарозным гелі стандартны хуткі рэцэпт — 0.02 працэнта w/v (200 мікраграмаў на mL) у вадзе, каля 15 хвілін афарбоўвання і каля 15 хвілін абясколервання ў вадзе з праглядам на светлавым стале з белым святлом. Для мембран класічны рэцэпт нозерн-блотынгу — 0.02 да 0.04 працэнта фарбавальніка ў ацэтаце натрыю пры pH каля 5.2, некалькі хвілін афарбоўвання пасля перанясення і імабілізацыі, затым прамыванне вадой і поўнае абясколерванне перад гібрыдызацыяй. Адчувальнасць невысокая: ад дзясяткаў да сотняў нанаграмаў на паласу ў гелі пры добрых умовах, а кансерватыўныя даведнікі ўказваюць 0.5 да 1 мікраграма. Гэта на парадкі больш за межы выяўлення брамідам этыдыю і фарбавальнікамі SYBR. Для мембран няма карыснай адзінай мяжы выяўлення асобнага транскрыпту, бо афарбоўванне пераважна паказвае рыбасомную РНК, якая прысутнічае ў вялікай колькасці, і агульны загружаны матэрыял. Не замяняйце фарбавальнік у гэтых рэцэптах рознічным растворам харчовай дабаўкі. Правераныя метады прадугледжваюць фарбавальнік аналітычнай чысціні, вызначаны склад буфераў і працу без РНКаз, калі выкарыстоўваецца РНК.

Як працуе звязванне і дзе яно можа ўвесці ў зман

Карысная мадэль мае тры складнікі. Па-першае, дадатна зараджаная сістэма кольцаў прыцягваецца да адмоўна зараджанага фасфатнага каркаса. Спектраскапічныя даследаванні паказваюць, што пры нізкай канцэнтрацыі солі дамінуе электрастатычны складнік, тады як мадэляванне і малекулярная дынаміка пацвярджаюць інтэркаляцыю і звязванне ў малой баразёнцы як устойлівыя рэжымы ўзаемадзеяння з двухланцуговай ДНК, як абагульнена ў спектраскапічным даследаванні звязвання метыленавага сіняга з ДНК. Па-другое, існуе пэўная перавага да GC: мадэляванне паказвае пераважнае звязванне на ўчастках CpG і GpC, а эксперыменты сведчаць пра пераважнае ўзаемадзеянне з дуплексамі, багатымі на GC, у працы пра перавагі інтэркаляцыі метыленавага сіняга, але звязванне адбываецца і з AT-дуплексамі. Звычайнае афарбоўванне не з'яўляецца спецыфічным да паслядоўнасці. Па-трэцяе, адналанцуговыя ДНК і РНК звязваюцца пераважна праз электрастатычныя ўзаемадзеянні і стэкінг з даступнымі асновамі і дуплекснымі ўчасткамі, таму інтэнсіўнасць афарбоўвання залежыць ад даўжыні, паслядоўнасці і другаснай структуры.

З гэтага вынікаюць два наступствы. Паколькі звязванне некавалентнае, фарбавальнік вымываецца. Палосы ў поліакрыламідзе хутка бляднеюць, калі іх спецыяльна не зафіксаваць; асобны варыянт з пастаяннай фіксацыяй існуе менавіта таму, што звычайнае афарбоўванне часовае, як апісана ў працы Сота і Дрэйпера пра гелі PAGE. Паколькі фарбавальнік з'яўляецца фотасенсібілізатарам, працяглае яркае асвятленне афарбаванай ДНК у прысутнасці кіслароду можа акісляць гуанін і ўрэшце выклікаць адналанцуговыя разрывы; гэты механізм падрабязна апісаны ў працы пра акісленне гуаніну, сенсібілізаванае метыленавым сінім. Кароткі прагляд у белым святле дазваляе пазбегнуць добра вядомага УФ-пашкоджання, характэрнага для класічных працэдур з брамідам этыдыю, і гэта рэальная перавага пры прэпаратыўным выдзяленні. Бачнае святло больш зберагальнае, але не бясшкоднае. Калі ДНК прызначана для кланавання, скарачайце час асвятлення. Больш шырокія фотахімічныя падставы гэтай засцярогі разгледжаны ў артыкуле пра два шляхі фотахіміі метыленавага сіняга. Пра акісляльна-аднаўленчую пару і зарадныя станы, якія тлумачаць, чаму акісленая форма звязваецца, а адноўленая — не, чытайце ў артыкуле пра хімію структуры і ўласцівасцей метыленавага сіняга.

Задача першая: афарбоўванне ў гелях

Афарбоўванне геля адказвае на адно пытанне: ці дастаткова ў гэтай паласе нуклеінавай кіслаты, каб убачыць яе няўзброеным вокам. Найлепш вывучаны выпадак — двухланцуговая ДНК у агарозе. Першапачатковы метад афарбоўвання геля метыленавым сінім, распрацаваны Флорэсам і калегамі, пацвердзіў прыдатнасць хуткага пратаколу з 0.02 працэнта фарбавальніка для 1-працэнтнай агарозы і паказаў магчымасць паспяховага наступнага выдзялення і кланавання. Той жа пратакол пастаўшчыка прыведзены на старонцы метыленавага сіняга IBI Scientific, дзе побач апісаны рэцэпт з 0.04 працэнта для мембран і хуткі варыянт для геляў.

Практычная працэдура:

1. Правядзіце электрафарэз звычайным спосабам. Афарбоўвайце пасля электрафарэзу, а не падчас яго, калі толькі перанясенне або раздзяляльная здольнасць не былі правераны для мадыфікаванага метаду.
2. Пагрузіце гель у 0.02 працэнта w/v метыленавага сіняга ў дыстыляванай вадзе прыкладна на 15 хвілін пры лёгкім пагойдванні.
3. Абяскольервайце, некалькі разоў змяняючы ваду, агулам каля 15 хвілін, пакуль фон матрыцы не зменшыцца і палосы не стануць выразнымі.
4. Адразу сфатаграфуйце на асвятляльніку з белым святлом.

Агароза і поліакрыламід паводзяць сябе па-рознаму. Агароза ўтрымлівае фарбавальнік у матрыцы, таму абясколерванне — павольны этап. Тонкія поліакрыламідныя гелі хутка афарбоўваюцца, але таксама хутка губляюць фарбавальнік, што дапамагае прэпаратыўнаму выразанню палос, але перашкаджае архіўнай фіксацыі вынікаў. Сінтэтычныя алігануклеатыды ў поліакрыламідзе можна лакалізаваць з дапамогай таго ж рэцэпту з 0.02 працэнта за 20 да 30 хвілін з паўторнымі прамываннямі вадой, прытрымліваючыся ўсталяваных метадаў PAGE у стылі Current Protocols. Апісаны вельмі разбаўленыя варыянты з канцэнтрацыяй каля 0.0002 працэнта ў разбаўленым TBE для прэпаратыўных алігануклеатыдаў на працягу некалькіх гадзін, але доказная база для іх слабейшая.

Адрозненне паміж ДНК і РНК мае значэнне. Двухланцуговая ДНК забяспечвае найбольш моцнае структурна арганізаванае звязванне. РНК і адналанцуговая ДНК афарбоўваюцца, але слабей і менш прадказальна. Для агарозных геляў з фармальдэгідам, якія выкарыстоўваюцца для РНК, большасць лабараторый прапускае афарбоўванне сінім у гелі і спачатку пераносіць РНК на мембрану, а затым афарбоўвае яе там. Так слабы сігнал у гелі замяняецца больш выразным сігналам на мембране і запісам, які дазваляе ацаніць загрузку.

Задача другая: афарбоўванне на мембранах

Афарбоўванне мембран адказвае на іншае пытанне: ці ўдалося перанясенне і ці можна параўноўваць дарожкі. Класічнае прымяненне — зварачальнае афарбоўванне для нозерн-блотынгу паводле Херына і Шміта: першапачаткова 0.04 працэнта фарбавальніка ў 50 mM ацэтаце натрыю пры pH 5.0 на працягу 2 да 3 хвілін з прамываннем вадой і выдаленнем фарбавальніка разбаўленым SDS у SSPE перад гібрыдызацыяй.

Шырока ўжываны сучасны варыянт выглядае так:

1. Перанясіце РНК або дэнатураваную ДНК на нейлон ці нітрацэлюлозу, затым імабілізуйце УФ-сшываннем або награваннем, каб узор не губляўся падчас афарбоўвання.
2. Неабавязковы, але распаўсюджаны этап: замачыце мембрану ў 5-працэнтнай воцатнай кіслаце прыкладна на 15 хвілін.
3. Афарбоўвайце 5 да 10 хвілін у 0.02 да 0.04 працэнта метыленавага сіняга ў 0.3 да 0.5 M ацэтаце натрыю пры pH каля 5.2.
4. Прамыйце і абяскольервайце ў вадзе 5 да 15 хвілін, зафіксуйце выяву, затым выдаліце рэшткі фарбавальніка перад гібрыдызацыяй.

У нозерн-блотынгу пераважна выкарыстоўваецца дадатна зараджаны нейлон. Нітрацэлюлоза таксама падыходзіць для той жа працэдуры з воцатнай кіслатой і ацэтатам. Выяву выкарыстоўваюць, каб пацвердзіць перанясенне, параўнаць палосы 28S і 18S (або 23S і 16S для бактэрыяльнай РНК), пазначыць маркеры памеру і стандарты, а таксама захаваць прыблізныя даныя для нармалізацыі па агульнай РНК. У апублікаваных метадах нозерн-блотынгу колькасна ацэньваюць афарбаваныя рыбасомныя палосы для праверкі загрузкі, у тым ліку ў даследаванні ў галіне малочнай навукі, дзе выкарыстоўвалі рыбасомныя палосы, афарбаваныя метыленавым сінім, для нармалізацыі. Мембраны для саўзерн-блотынгу можна візуалізаваць такім жа чынам, але фарбавальнік значна лепш зарэкамендаваў сябе для праверкі загрузкі і перанясення ў нозерн-блотынгу; да таго ж ДНК для саўзерн-блотынгу дэнатуруюць перад перанясеннем, таму значэнні адчувальнасці для геляў сюды не пераносяцца.

Межы выяўлення і фон: дзе сіні прайграе

Прыведзенае ніжэй параўнанне наўмысна прыблізнае. Эфектыўнасць афарбоўвання залежыць ад працэнтнага складу геля, шырыні паласы, оптыкі і дакладнасці выканання абясколервання. Успрымайце кожную лічбу як ацэнку парадку велічыні, а не як спецыфікацыю.

Кантроль фону вызначае, ці можна выкарыстоўваць гэты адносна слабы сігнал. Свабодны фарбавальнік мае інтэнсіўны колер, таму кантраст дасягаецца выдаленнем незвязанага фарбавальніка без выдалення звязанага. Больш канцэнтраваны фарбавальнік рэдка павышае адчувальнасць. Пераважна ён павялічвае час абясколервання. Правядзіце серыю развядзенняў менавіта на тым гелі, мембране і камеры, якія выкарыстоўваеце, і карыстайцеся толькі дыяпазонам, дзе інтэгральная аптычная шчыльнасць застаецца прапарцыйнай унесенай колькасці. Метыленавы сіні дазваляе праводзіць паўколькасную нармалізацыю загрузкі. Гэта не колькасны аналіз з шырокім дынамічным дыяпазонам, бо ёмістасць мембраны, эфектыўнасць перанясення, насычэнне і абясколерванне адрозніваюцца паміж дарожкамі.

Абмежаванні сумяшчальнасці: што захоўваецца пасля афарбоўвання

Магчымасць кланавання пасля афарбоўвання сінім прадэманстравана. Флорэс і калегі выразалі афарбаваныя палосы з агарозы, выдзялялі ДНК, праводзілі лігаванне і трансфармацыю, паведамляючы пра лепшыя вынікі кланавання, чым пасля браміду этыдыю з УФ-асвятленнем. Верагодная прычына — меншае фотапашкоджанне, а не карысць самога фарбавальніка. Абмяжоўвайце ўздзеянне белага святла і праводзьце стандартную ачыстку ДНК пры выдзяленні з геля.

Для ПЛР і секвенавання доказаў менш. Рэшткавы фарбавальнік звязваецца з нуклеінавымі кіслотамі, таму перад ферментатыўнымі этапамі праводзьце абясколерванне і ачыстку. Чакаецца, што належным чынам ачышчаная ДНК з геля, афарбаванага сінім, будзе прыдатная, але дапушчальныя ўзроўні непасрэднага пераносу фарбавальніка для розных палімераз і хімічных сістэм секвенавання недастаткова колькасна вывучаны. Не лічыце такую пераноснасць дадзенасцю.

Блот-гібрыдызацыя сумяшчальная з афарбоўваннем пры строгім парадку: перанясенне, імабілізацыя, афарбоўванне, фіксацыя выявы, абясколерванне, гібрыдызацыя. Гэтая паслядоўнасць ляжыць у аснове метаду Херына і Шміта. Афарбоўванне да перанясення або пропуск абясколервання — ужо іншы метад, які патрабуе ўласнай праверкі. Пасля выдалення фарбавальніка стандартнае выдаленне зонда і паўторная гібрыдызацыя з зондам адбываюцца звычайным чынам. Пра афарбоўванне на клетачным узроўні фарбавальнікамі той жа групы і пра тое, чаму прынцыпы працы з фіксаванымі мазкамі не пераносяцца на метады для жывых клетак, чытайце ў атласе афарбоўвання для мікраскапіі.

Выразанне палос падыходзіць для прэпаратыўнай агарозы і для алігануклеатыдаў у PAGE, лакалізаваных з дапамогай сіняга, пры ўмове, што не выкарыстоўваецца варыянт з пастаяннай фіксацыяй. Электраэлюцыя пасля абясколервання хімічна праўдападобная для зварачальнага звязвання, але кантраляваных даных пра выхад менавіта пры выкарыстанні метыленавага сіняга мала. Пасля элюцыі праводзьце абяссольванне або асаджэнне.

Праблемы, якія паўтараюцца

Слабыя палосы ў гелі звычайна азначаюць занадта малую масу для каларыметрычнага афарбоўвання, асабліва калі гэта кароткія адналанцуговыя мішэні або РНК. Загружайце больш матэрыялу, выкарыстоўвайце свежы фарбавальнік, падаўжайце афарбоўванне перад павышэннем канцэнтрацыі і раней спыняйце абясколерванне. Суцэльна сіні гель без кантрасту звычайна азначае празмернае афарбоўванне або недастатковую колькасць змен вады. Знікненне палос у PAGE — чаканае хімічнае паводжанне, а не няўдалае афарбоўванне. Фатаграфуйце хутка. Нераўнамерны фон мембраны паказвае на складкі, бурбалкі, адбіткі пальцаў, нераўнамернае пагойдванне або перанясенне асобнымі ўчасткамі. Без кантролю гібрыдызацыі не трактуйце гэта як неаднолькавую загрузку. Размыты і слабы рыбасомны малюнак можа азначаць дэградацыю, але таксама няпоўнае перанясенне, занадта малую колькасць агульнай РНК (звычайна ў дарожкі ўносяць ад некалькіх да дзясяткаў мікраграмаў) або празмернае абясколерванне. Фарбавальнік паказвае рыбасомную РНК, якая прысутнічае ў вялікай колькасці. Ён не паказвае канкрэтны транскрыпт. Гэта задача зонда.

Бяспека і абыходжанне без перабольшанняў

З метыленавым сінім прасцей працаваць, чым з брамідам этыдыю, але ён не бясшкодны. Актуальны пашпарт бяспекі MilliporeSigma адносіць фарбавальнік да катэгорыі 4 вострай таксічнасці пры прыёме ўнутр — шкодны пры праглынанні — і патрабуе ўтылізацыі праз ухвалены канал абыходжання з адходамі паводле пашпарта бяспекі метыленавага сіняга Sigma-Aldrich. Для браміду этыдыю дзейнічаюць больш строгія папярэджанні пра генатаксічнасць, у тым ліку пра меркаванае ўздзеянне на палавыя клеткі ў яго пашпарце бяспекі Sigma-Aldrich, а яго гелі і растворы звычайна збіраюць асобна як небяспечныя хімічныя адходы, як адзначана ў даведніку Thermo Fisher па фарбавальніках для нуклеінавых кіслот. Для абодвух рэчываў выконвайце патрабаванні пашпартоў бяспекі і правілы ўстановы. Захоўвайце сухі фарбавальнік шчыльна закрытым і ў сухім стане, паўторна выкарыстоўвайце рабочы раствор толькі ў межах, дазволеных пратаколам, захоўвайце афарбаваныя мембраны сухімі паміж лістамі фільтравальнай паперы і фатаграфуйце гелі да таго, як палосы расплывуцца праз дыфузію.

Запомніце простае лабараторнае правіла. Гелі правяраюць бачнасць пры вялікай загрузцы ў белым святле. Мембраны правяраюць перанясенне і загрузку перад тым, як зонд выканае адчувальнае выяўленне. Адзін фарбавальнік служыць абедзвюм задачам — з невысокай адчувальнасцю, зварачальным звязваннем і строгім парадкам дзеянняў.