Інтэрпрэтацыя выгляду калоній E. coli і іншых арганізмаў на агары EMB

Студэнт высейвае невядомы арганізм штрыхавым метадам на агар з эазінам і метыленавым сінім, інкубуе яго на працягу ночы і потым бачыць чашку з цёмнымі калоніямі з зялёным пералівам. У лабараторным сшытку з'яўляецца запіс: «E. coli, пацверджана». Гэты запіс сцвярджае больш, чым можна абгрунтаваць па чашцы. Чашка паказвае фенатып росту і ферментацыі ў пэўных умовах. Відавая прыналежнасць — асобная выснова, якая патрабуе асобных доказаў.

У гэтым дапаможніку вынікі на агары EMB разглядаюцца як задача інтэрпрэтацыі. Ён тлумачыць асноўны прынцып, паслядоўна разбірае ілюстрацыйны атлас чашак з кантролямі і называе выпадкі, калі карціна з падручніка ўводзіць у зман.

Прынцып працы асяроддзя

Агар EMB адначасова селектыўны і дыферэнцыяльны. Фарбавальнікі эазін Y і метыленавы сіні прыгнятаюць многія грамдадатныя арганізмы, таму асяроддзе спрыяе росту грамадмоўных арганізмаў. Тыя ж фарбавальнікі дзейнічаюць як індыкатары: калі арганізм ферментуе даступны цукар і ўтварае дастаткова кіслаты ў лакальнай зоне, калонія інтэнсіўна паглынае фарбавальнік і становіцца ад цёмна-фіялетавай да сіне-чорнай. Пры інтэнсіўным утварэнні кіслаты паверхня калоніі можа мець металічны зялёны пераліў. Пратакол ASM для чашак з агарам з эазінам і метыленавым сінім апісвае гэтае спалучэнне селекцыі і дыферэнцыяцыі і змяшчае эталонныя фатаграфіі для навучання.

Перад інтэрпрэтацыяй любога выніку важна ўлічыць адну дэталь: праверце, які састаў асяроддзя выкарыстоўваецца. Старэйшы варыянт Holt Harris Teague змяшчае лактозу і цукрозу, а Levine EMB — толькі лактозу. Арганізм, які ферментуе цукрозу, але не лактозу, напрыклад многія ізаляты Serratia marcescens, можа выглядаць па-рознаму на гэтых двух варыянтах. У дакументацыі вытворцы асяроддзяў EMB гэтае адрозненне саставу пазначана непасрэдна. Запісвайце вытворцу і састаў у лабараторны сшытак разам з вынікам.

Прыгатаваны агар EMB без пасеву звычайна мае колер ад чырвона-карычневага да чырванавата-фіялетавага, часам з зеленаватым адценнем або дробным асадкам. Гэты фонавы колер не з'яўляецца ростам. Пры кожнай ацэнцы параўноўвайце вынік з чашкай без пасеву або з задакументаваным зыходным выглядам асяроддзя і ацэньвайце чашку першаснага пасеву прыкладна праз 18 да 24 гадзін аэробнай інкубацыі пры 35 да 37 C, калі навучальны пратакол не вызначае іншага. Працяглая інкубацыя можа змяніць знешнія праявы ферментацыі.

Як аглядаць чашку

Выкарыстоўвайце два віды асвятлення. Спачатку агледзьце чашку ў адбітым святле або пры касым асвятленні і нахіліце яе: металічны бляск пераліваецца і можа з'яўляцца або знікаць у залежнасці ад вугла назірання. Потым агледзьце яе ў праходным святле, каб ацаніць колер калоній і цёмныя цэнтры. Ацэньвайце добра ізаляваныя калоніі, бо шчыльны рост і суседнія калоніі змяняюць лакальнае назапашванне кіслаты і могуць аслабляць або ўзмацняць афарбоўку. Набор выяў ASM непасрэдна дэманструе гэта: E. coli ў змешанай культуры можа губляць чаканы бляск, таму што суседнія арганізмы змяняюць кіслотнае асяроддзе.

Уключайце кантролі, калі гэта дазваляе практычнае заданне. Распаўсюджаны навучальны набор уключае E. coli ATCC 25922 для фенатыпу з сіне-чорнай афарбоўкай і металічным бляскам, неферментуючы арганізм, напрыклад Salmonella Typhimurium ATCC 14028 або Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, для бясколернага фенатыпу і грамдадатны арганізм, напрыклад Enterococcus faecalis або Staphylococcus aureus, як кантроль прыгнятання росту, як указана ў стандартных табліцах кантролю якасці для асяроддзяў EMB. Калі ў станоўчага кантролю няма бляску, спачатку падазравайце ўмовы інкубацыі, шчыльны рост або састаў асяроддзя, а не асаблівасці невядомага арганізма.

Ілюстрацыйны атлас чашак

Прыведзеныя ніжэй чашкі — гэта згенераваныя ілюстрацыі, а не фатаграфіі рэальных культур. Яны паказваюць характэрныя прыкметы, на якія варта звяртаць увагу, а не дакладнае адценне якога-небудзь асобнага штама. Параўноўвайце іх з эталоннымі фатаграфіямі ASM і з рэальнымі чашкамі з навучальнай лабараторыі.

Чашка 1: Escherichia coli на агары EMB, інтэнсіўная ферментацыя лактозы

E. coli на агары EMB звычайна мае колер ад цёмна-фіялетавага да сіне-чорнага, часта з цёмным цэнтрам і металічным зялёным бляскам, выкліканым інтэнсіўным утварэннем кіслаты. Бляск — гэта вядомая прыкмета, якую шукаюць студэнты, але разглядайце яго як дадатковы доказ, а не як вызначальную прыкмету. Інтэнсіўнасць бляску залежыць ад штама, часу інкубацыі, шчыльнасці калоній і вугла назірання. Адсутнасць бляску не выключае E. coli, а цёмная калонія без бляску можа адпавядаць некалькім іншым ферментуючым арганізмам. Для любых далейшых даследаванняў выбірайце добра ізаляваную калонію, а не ацэньвайце ўчастак са шчыльным ростам.

Чашка 2: Klebsiella pneumoniae на агары EMB, слізістыя ферментуючыя калоніі

Klebsiella pneumoniae на агары EMB звычайна ўтварае буйныя, бліскучыя, слізістыя калоніі ў адценнях ад ружова-фіялетавага да карычнева-фіялетавага, часта з цёмнымі цэнтрамі, але звычайна без моцнага металічнага бляску. Падобная марфалогія сустракаецца ў роднасных ферментуючых арганізмаў, напрыклад Enterobacter. Слізістая кансістэнцыя і памер калоніі — частка ацэнкі: маленькая плоская ружовая калонія мае іншае інтэрпрэтацыйнае значэнне, чым буйная выпуклая слізістая. Як і ў выпадку з E. coli, чашка дазваляе меркаваць пра фенатып ферментацыі, а вызначэнне віду патрабуе біяхімічнага пацвярджэння, апісанага ніжэй.

Чашка 3: Salmonella на агары EMB і іншыя неферментуючыя арганізмы, бясколерныя калоніі

Salmonella на агары EMB і роднасныя арганізмы, якія не ферментуюць лактозу, у тым ліку Shigella і многія ізаляты Pseudomonas, звычайна растуць у выглядзе бясколерных, напаўпразрыстых або бледна-бурштынавых калоній. Некаторыя саставы асяроддзя і ўмовы даюць слабае ружаватае адценне, таму бледна-ружовая калонія не азначае аўтаматычна ферментуючы арганізм. EMB не адрознівае Salmonella ад Shigella або іншых неферментуючых арганізмаў; для гэтага патрэбныя наступныя тэсты. Улічвайце таксама, што задакументаваны лактозададатныя штамы Salmonella з металічна бліскучымі калоніямі, падобнымі да E. coli, — гэта яшчэ адна прычына, чаму адна чашка не дазваляе зрабіць канчатковую выснову.

Чашка 4: Serratia marcescens і пастка саставу асяроддзя

Serratia marcescens заслугоўвае асобнага раздзела, бо студэнты часта чакаюць чырвоных калоній і таму няправільна інтэрпрэтуюць чашку. Большасць клінічных ізалятаў не ферментуе лактозу, таму на Levine EMB яны звычайна выглядаюць бледнымі або слаба афарбаванымі. Паколькі многія ізаляты ферментуюць цукрозу, састаў з цукрозай можа даваць больш цёмную афарбоўку або больш выяўленую рэакцыю, звязаную з утварэннем кіслаты. Не чакайце і класічнага чырвонага пігменту прадыгіязіну пры 35 да 37 C; утварэнне пігменту пры тэмпературы інкубатара ненадзейнае. Калі ў пратаколе згадваецца Serratia marcescens на агары EMB, праверце, які састаў асяроддзя маецца на ўвазе. Агляд метабалізму Serratia абагульняе адсутнасць ферментацыі лактозы і варыябельнасць ферментацыі цукрозы, якія ляжаць у аснове гэтай пасткі.

Чашка 5: кантролі і арганізмы з прыгнечаным ростам

Грамдадатныя арганізмы, такія як Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus і Bacillus, звычайна не растуць на агары EMB або іх рост значна прыгнятаецца, хоць прыгнятанне не з'яўляецца абсалютным для кожнага штама. Набор кантроляў дазваляе абгрунтавана ацэньваць вынік: кантроль E. coli павінен паказваць добры рост з сіне-чорнай афарбоўкай і бляскам, кантроль неферментуючага арганізма — бясколерны рост, а кантроль прыгнятання — нязначны рост або яго адсутнасць. Калі кантроль прыгнятання расце добра, селектыўнасць не спрацавала, і ўсе астатнія вынікі для гэтай партыі выклікаюць сумневы. Метады афарбоўвання адказваюць на іншае пытанне, чым пажыўныя асяроддзі; пра лабараторнае афарбоўванне прэпаратаў на прадметным шкле глядзіце атлас афарбоўвання метыленавым сінім.

Параўнанне з улікам абмежаванняў

Тры сказы абагульняюць знешнія прыкметы, якія ўводзяць у зман. Цёмны колер не азначае E. coli, бо Klebsiella, Enterobacter і іншыя ферментуючыя арганізмы ўтвараюць цёмныя цэнтры без бляску. Ружовы колер не азначае Klebsiella, бо арганізмы з умеранай або павольнай ферментацыяй і некаторыя арганізмы, якія звычайна лічацца неферментуючымі, выглядаюць ружовымі або светла-фіялетавымі. Бляск не азначае канчатковага пацвярджэння E. coli, бо яго могуць утвараць іншыя інтэнсіўна ферментуючыя арганізмы. Навучальны пратакол і яго выявы змешаных культур ілюструюць кожную з гэтых памылак.

Межы пацвярджэння

Агар EMB паказвае фенатып, а не від. Розныя арганізмы могуць мець аднолькавы выгляд калоній, а адзін арганізм можа адхіляцца ад сваёй карціны з падручніка ў залежнасці ад штама, узросту культуры, шчыльнасці росту, саставу асяроддзя і ўмоў інкубацыі. Менавіта таму ў навучальных і клінічных працэсах марфалогію на EMB лічаць папярэдняй прыкметай.

Абгрунтаваны парадак працы студэнта такі: апісаць ізаляваную калонію (памер, колер, цэнтр, бляск пры касым асвятленні, слізістасць), запісаць састаў асяроддзя, час і тэмпературу інкубацыі, а таксама вынікі кантроляў; затым перасеяць добра ізаляваную калонію для атрымання чыстай культуры перад любым пацвярджальным тэстам. Звычайныя наступныя даследаванні ўключаюць афарбоўванне па Граму разам з рэакцыямі IMViC для папярэдняй ідэнтыфікацыі E. coli і каліформных бактэрый, TSI або KIA і спецыфічныя для арганізмаў біяхімічныя панэлі для кішэчных арганізмаў, а таксама сералагічную ідэнтыфікацыю, MALDI TOF або іншыя валідзіраваныя метады ідэнтыфікацыі, калі гэтага патрабуе задача. Каб даведацца, якое месца займае EMB сярод селектыўных і дыферэнцыяльных асяроддзяў для кішэчных арганізмаў, звярніцеся да ўводных матэрыялаў пра такія пажыўныя асяроддзі і наступнае афарбоўванне па Граму. У звязаным пытанні пра тое, што можа і чаго не можа даказаць сіняя афарбоўка прэпарата, атлас афарбоўвання метыленавым сінім гэтак жа аддзяляе назіранне ад высновы.

Запісвайце назіранне перад высновай. «Цёмныя сіне-чорныя калоніі з зялёным бляскам, які залежыць ад вугла назірання, на Levine EMB праз 24 гадзіны, што адпавядае інтэнсіўнай ферментацыі лактозы» — абгрунтаваны запіс. «E. coli, пацверджана» патрабуе этапу пацвярджэння, якога адна чашка забяспечыць не можа.