Хто распрацаваў пурпурную афарбоўку крыві? Метыленавы сіні, Малахоўскі, Раманоўскі і Гімза

Эазін чырвоны. Метыленавы сіні — сіні. Змяшайце іх, нанясіце сумесь на высушаны мазок крыві, і некаторыя яго часткі стануць пурпурнымі.

Не ўсе часткі. У добра падрыхтаваным прэпараце ядры лейкацытаў набываюць чырвона-пурпурны колер, і такі ж колер набывае храмацін унутры малярыйнага паразіта, тады як навакольныя эрытрацыты застаюцца ружовымі, а цытаплазма — шэра-сіняй. Менавіта пурпурны колер дазваляе адрозніваць тыпы клетак.

Ні ў адным з флаконаў няма пурпурнага колеру. Ён з'яўляецца толькі тады, калі пэўны прадукт распаду метыленавага сіняга сустракаецца з эазінам на прадметным шкле. У 1880-х і 1890-х гадах ніхто не ведаў нават пра існаванне гэтага прадукту, не кажучы ўжо пра тое, што ён сабой уяўляў. Людзі, якія шукалі гэты колер, працавалі паасобку з нячыстымі фарбавальнікамі і не мелі надзейнага спосабу высветліць, што знаходзіцца ў флаконе пасля двух месяцаў захоўвання на паліцы.

Таму на пытанне ў загалоўку ёсць больш чым адзін абгрунтаваны адказ, і таму гэты адказ змяніўся ў 2011 годзе.

Што станавілася бачным са зменай сумесі

Гэты спосаб афарбоўкі не быў вынайдзены за адзін раз. Ён складваўся паступова. Кожная змена сумесі давала роўна адну новую дэталь, якую можна было ўбачыць, і паслядоўнасць гэтых дэталяў — самы наглядны спосаб прасачыць гісторыю.

Важная заканамернасць бачная ў апошнім слупку. Кожны крок наперад пашыраў колеравую гаму, а кожнае такое пашырэнне рабіла бачнай яшчэ адну структуру. Пурпурны колер — не ўпрыгожанне методыкі; гэта розніца паміж магчымасцю ўбачыць наяўнасць паразіта і магчымасцю ўбачыць, з чаго ён складаецца. Пра тое, як сам фарбавальнік трапіў з фарбавальнага завода BASF у медыцыну, распавядае больш доўгая гісторыя са сваімі дакументамі. Поўная паслядоўнасць, прыведзеная вышэй, з крыніцай для кожнага запісу захоўваецца як храналогія ўкладу даследчыкаў са спасылкамі на крыніцы.

Малюнак: тыя самыя шэсць сумесей, паказаныя праз іх склад і атрыманы вынік. Кругі паказваюць фарбавальнікі; блокі пад імі — колеры, якія гэтыя фарбавальнікі маглі даць у мазку крыві. Да 1890 года чырвона-пурпурнага блока няма нідзе, а пасля яго — ён ёсць усюды.

Чалавек, які мэтанакіравана выкарыстаў буру

Эрнст Малахоўскі быў лекарам у Брэслаў, цяпер Вроцлаве. Ён усё прафесійнае жыццё займаўся прыватнай практыкай і працаваў у невялікай клініцы, якой кіраваў разам з калегам, а лабараторныя даследаванні праводзіў у вольны час. Ён нарадзіўся ў Стшэльне 12 сакавіка 1857 года, вывучаў медыцыну ва ўніверсітэце Брэслаў і з 1882 да 1887 года працаваў асістэнтам у аддзяленні ўнутраных хвароб бальніцы Усіх Святых, якая тады была другой паводле велічыні бальніцай Германіі.

У 1888 годзе ён пачаў працаваць з падвойнай афарбоўкай Хэнцінскага і Плена. У прэпараце, зробленым у 1889 годзе, ён заўважыў, што храмацін ядра плазмодыя афарбоўваецца інакш, чым цытаплазма, але потым не змог паўтарыць вынік. Ён паспрабаваў падкісліць метыленавы сіні, што толькі пагоршыла справу. Паспрабаваў падшчолачыць яго бурай — і гэта спрацоўвала кожны раз. Ён публічна прадэманстраваў метад 15 чэрвеня 1890 года, а ў жніўні 1891 года апублікаваў больш падрабязнае апісанне, у тым ліку інструкцыю па выкарыстанні буры. Ён адзначыў, што афарбоўка займала дваццаць чатыры гадзіны і што вынікі лёгка ўзнаўляліся.

Дваццаць чатыры гадзіны — доўгі час для дыягнастычнай лабараторыі, а ў сваім артыкуле ён не засяроджваўся на пурпурна-чырвоным колеры ядра паразіта. Якой бы ні была прычына, ніхто не ўзяўся за мэтанакіраванае падшчолачванне метыленавага сіняга, пакуль Нохт не зрабіў гэта зноў у 1898 годзе. Малахоўскі больш ніколі не пісаў пра афарбоўку крыві.

Прычына, па якой да нядаўняга часу пра яго было так мала вядома, звязаная з архівамі, а не з нейкай таямніцай. У медыцынскай літаратуры амаль не захавалася слядоў яго жыцця, а тое, што захавалася, дайшло да нас адным шляхам. Яго дачка Марыя ў 1939 годзе выехала з Германіі ў Лондан, служыла ў брытанскай арміі і пасялілася ў Канадзе, а яе збор сямейных дакументаў у рэшце рэшт трапіў у Інстытут Леа Бека ў Нью-Ёрку. Яе брат Леа загінуў у Першай сусветнай вайне. Яе сястру Эву ў красавіку 1942 года дэпартавалі з Брэслаў у транзітны лагер Ізбіца, і яна не вярнулася. Яе маці Гедвіг 22 красавіка 1942 года скончыла жыццё самагубствам, каб не чакаць такой жа дэпартацыі. Малахоўскі памёр у 1934 годзе, яшчэ да ўсіх гэтых падзей.

Сямейную гісторыю, якая заканчваецца такім чынам, перастаюць цытаваць. Два артыкулы, што вярнулі Малахоўскаму месца ў гісторыі развіцця гэтай афарбоўкі, абодва апублікаваныя ў 2011 годзе, былі падрыхтаваныя на аснове архіўных дакументаў у Познані і Вроцлаве, а таксама дакументаў Марыі ў Нью-Ёрку.

Флакон з цвіллю і ўдачлівы расіянін

Дзмітрый Раманоўскі вывучаў медыцыну ў Ваенна-медыцынскай акадэміі ў Санкт-Пецярбургу і большую частку сваёй кар'еры займаўся малярыяй. У 1890 годзе ён апублікаваў метад, які на паперы быў амаль ідэнтычны метаду Хэнцінскага: нязменены метыленавы сіні і эазін, толькі эазіну было крыху больш.

У верасні 1891 года ён апублікаваў метад, які зрабіў яго імя вядомым, а важная дэталь хавалася ў інструкцыях. Найлепшыя вынікі ён атрымліваў з die vorräthige Methylenlösung — запасным растворам метыленавага сіняга, які прастаяў больш за два месяцы і на якім вырасла цвіль. Цвіль і працяглае захоўванне часткова дэметыліравалі фарбавальнік. Раманоўскі гэтага не ведаў і не мог кантраляваць працэс, а іншыя даследчыкі, якія спрабавалі яго метад, не маглі атрымаць пурпурны колер. Яго дысертацыя была пададзеная ў Санкт-Пецярбургу ў чэрвені 1891 года, таму ў агульнапрынятым выкладзе годам адкрыцця лічыцца 1891.

Дэманстрацыя Малахоўскага адбылася ў чэрвені 1890 года, больш чым на год раней, і яго метад даваў вынік мэтанакіравана.

Чаму метад назвалі імем не таго чалавека

Аргументы на карысць Малахоўскага сабралі Крысцін Крафтс, Эрнст Гемпельман і Барбара Алексін, і яны абапіраюцца на чатыры рэчы. Дата публічнай дэманстрацыі: чэрвень 1890 года супраць верасня 1891 года. Слова мэтанакіравана супраць слова выпадкова. Той факт, што Малахоўскі апублікаваў свой метад цалкам, уключаючы выкарыстанне буры, тады як метад Раманоўскага залежаў ад некантраляванай зменнай. І назіранне, што апісанне ядра плазмодыя разам з пурпурным колерам, які зрабіў яго бачным, фактычна знікла з літаратуры на сем гадоў, бо ніхто не мог паўтарыць выпадкова атрыманы варыянт.

Сваю выснову яны выказваюць без абыходных слоў. У біяграфічным артыкуле яны называюць такое прыпісванне заслугі «скажэннем справядлівасці» і цытуюць Ральфа Лілі, які ў 1978 годзе напісаў: «магчыма, нам варта называць гэтую групу спосабаў афарбоўкі афарбоўкамі Малахоўскага».

Гэтае сцверджанне аспрэчваецца, як звычайна бывае з прэтэнзіямі на прыярытэт, і характар спрэчкі варта растлумачыць, а не вырашаць яе. У спрэчцы пра прыярытэт трэба вызначыць, што менавіта было адкрыццём. Калі адкрыццё — пурпурны колер, то ў Малахоўскага ёсць ранейшая задакументаваная дэманстрацыя. Калі адкрыццё — апублікаваны метад, то абодва даследчыкі апублікавалі яго ў 1891 годзе, а назву метад атрымаў паводле імя Раманоўскага. Калі адкрыццё — тлумачэнне, то ніводзін з іх не можа прэтэндаваць на яго, бо ніводзін не ведаў, што паспяванне было дэметыліраваннем, і ніводзін не мог сказаць, чаму наогул з'яўляецца гэты колер. Менавіта апошні момант прапускаюць папулярныя выклады. Актыўным кампанентам была прымесь, якую ніхто не ідэнтыфікаваў, а першы чалавек, які мэтанакіравана атрымаў гэты колер, зрабіў гэта паводле ўзнаўляльнага эмпірычнага рэцэпта, а не дзякуючы разуменню таго, як гэты рэцэпт працуе.

Два артыкулы 2011 года — найбольш поўны апублікаваны выклад аргументаў на карысць Малахоўскага, і абодва можна бясплатна прачытаць праз PubMed: вялікі агляд — PMID 21235291, біяграфічны артыкул — PMID 21660627. Запіс агляду ў PubMed таксама змяшчае каментарый да яго, апублікаваны ў тым самым часопісе пазней у тым жа годзе, 86(5):366. Гэта слушны напамін пра тое, што аргументы пачалі аспрэчваць у друку адразу пасля іх з'яўлення.

Гэтая спрэчка — не рознагалоссе наконт хіміі. Усе яе ўдзельнікі згодныя ў тым, што сабой уяўляе пурпурны колер і якія кампаненты яго ўтвараюць. Рознагалоссе датычыцца таго, хто атрымаў яго першым і ці можна наогул лічыць дасягненнем выпадковы вынік, які ніхто не мог паўтарыць.

Што далі пазнейшыя даследчыкі

Калі Малахоўскі першым атрымаў пурпурны колер, чаму афарбоўка носіць імёны Раманоўскага, Райта і Гімзы?

Таму што сумесь, якая спрацоўвае аднойчы ў руках свайго вынаходніка, — яшчэ не рэагент. Пазнейшыя працы ператварылі капрызную сумесь у нешта, чым лабарант у іншай краіне мог скарыстацца ў звычайны аўторак.

Нохт прыйшоў да выніку праз разважанні. Пасля таго як ён не змог атрымаць надзейны вынік ад простага нейтральнага фарбавальніка, ён зрабіў выснову, што пурпурны колер павінен паходзіць ад чагосьці ў метыленавым сінім, што не з'яўляецца самім метыленавым сінім, і пачаў гэта шукаць. Уна ўжо заўважыў, што вытрыманыя растворы метыленавага сіняга афарбоўваюць гранулы тучных клетак у чырвоны колер, і выказаў меркаванне, што пры паспяванні фарбавальніка ўтвараецца новае рэчыва. Бернтзен у 1885 годзе паказаў, што ў шчолачных умовах метыльныя групы адшчапляюцца ад метыленавага сіняга і што гэтыя прадукты — тое, што мы цяпер называем азурамі. Нохт экстрагаваў актыўную фракцыю хлараформам і мог назваць яе толькі Rot aus Methylenblau — чырвоны з метыленавага сіняга; Міхаэліс у 1901 годзе назваў яе азурам I. Джэнер вырашыў праблему практычнага выкарыстання. Паўторнае растварэнне асадку метыленавага сіняга і эазіну ў абсалютным метаноле давала адзіны стабільны раствор, які фіксаваў мазок падчас афарбоўкі і дазволіў адмовіцца ад фіксацыі награваннем. Лейшман і Ройтэр спалучылі паліхромны фарбавальнік са спіртавым растваральнікам і атрымалі адначасова стабільнасць і пурпурны колер. Райт замяніў дванаццацігадзінную інкубацыю пры 65 °C і дзесяць дзён вытрымкі адной гадзінай у патоку пары. Гімза ўвогуле перастаў спадзявацца на раствор, які паспяваў выпадковым чынам: ён выкарыстоўваў адмераныя колькасці вядомых фарбавальнікаў і дадаваў гліцэрын у метанол, каб прадукт вытрымліваў трапічную спёку. Ён ніколі не апублікаваў, як атрымліваў чысты метыленавы азур. Ён прадаў яго лабараторыі доктара Грублера ў Лейпцыгу, якая прадавала яго як азур I і сцвярджала, што толькі яе варыянт з'яўляецца сапраўдным фарбавальнікам Гімзы.

Пра тое, чым менавіта быў гэты азур, спрачаюцца дагэтуль. Адны лічаць, што гэта быў проста паліхромны метыленавы сіні, іншыя — што ён быў багаты на Azure B. Адказ з'явіўся праз вайну. Калі нямецкія фарбавальнікі сталі недаступнымі, група Службы грамадскага здароўя Злучаных Штатаў — Ральф Лілі разам з Морысам Роў і Эмі Уілкакс — выявіла, што найлепшую афарбоўку даюць тры раздзяленыя кампаненты: нязменены метыленавы сіні, яго дэметыліраваны прадукт распаду Azure B і эазін. Azure B замяніў недаступны азур I, і гэтыя тры кампаненты дагэтуль складаюць аснову фарбавальніка, які сёння выкарыстоўваецца для дыягностыкі малярыі.

Хімія ўзаемадзеяння гэтых трох кампанентаў на прадметным шкле — асобнае пытанне і тэма іншай старонкі. У артыкуле пра ролі фарбавальнікаў і хімію афарбовак тыпу Раманоўскага тлумачыцца, што робяць Azure B і эазін паасобку і чаму разам яны даюць колер, якога ніводзін не дае самастойна. Старонка пра мікраскапію і лабараторнае прымяненне прысвечаная практычнаму боку: што паказвае пэўны прэпарат і як ацаніць, ці падыходзіць канкрэтны прадукт для метаду, які вы збіраецеся выкарыстоўваць.

Частка гісторыі, якая застаецца актуальнай

Адна дэталь гэтай гісторыі не страціла актуальнасці ў 1902 годзе. Прыкладна пяцьдзесят гадоў найважнейшым кампанентам стандартнага ва ўсім свеце фарбавальніка для выяўлення малярыі была безыменная прымесь. Яна трапляла туды выпадкова, яе колькасць адрознівалася ад флакона да флакона, пэўны час яе склад быў камерцыйнай таямніцай, а пра яе долю спрачаліся да 1940-х гадоў. Людзі, якія карысталіся фарбавальнікам, не былі нядбайнымі. Яны не мелі магчымасці даведацца, што знаходзіцца ў флаконе.

Сучасны варыянт той самай праблемы — спецыфікацыя, якая апісвае толькі частку матэрыялу. Адпаведнасць USP — шлях да найвышэйшай чысціні, якую прапануе рынак, бо гэта поўны апублікаваны стандарт, а не адзінкавае вымярэнне: ідэнтычнасць, чысціня, арганічныя прымесі, у тым ліку азуравыя фарбавальнікі, рэшткавыя растваральнікі, элементныя прымесі, астатак пасля пракальвання, дапушчальныя мікрабіялагічныя паказчыкі і бактэрыяльныя эндатаксіны. Blupreme атрымлівае метыленавы сіні ад фармацэўтычнага вытворцы і публікуе поўны сертыфікат аналізу, каб кожны пункт гэтага спісу можна было праверыць, а не проста прыняць на веру. Сертыфікат, які паведамляе вынік аналізу на цяжкія металы і называе гэта адпаведнасцю USP, — сучасны эквівалент флакона з надпісам «паспелы метыленавы сіні»: магчыма, гэта выдатны рэагент, але этыкетка не кажа вам, што ў ім знаходзіцца.