Mikroskopiya üçün metilen mavisinə alternativlər: tapşırığa görə seçim

Sadə bakterial yaxma üçün məqsəd hüceyrə formasını görməkdirsə, kristal violet metilen mavisini əvəz edə bilər. Canlı hüceyrələr üçün daha yaxşı alternativ ümumiyyətlə boya istifadə etmədən faza-kontrast mikroskopiya ola bilər. Seçim aparmalı olduğunuz müşahidədən asılıdır.

Tutaq ki, iki nəfər eyni bakterial kulturanı araşdırır. Biri çöpşəkilli hüceyrələri dairəvi hüceyrələrdən ayırmaq istəyir. Digəri isə bir müalicənin bakteriyaları öldürüb-öldürmədiyini bilmək istəyir. Birinci şəxsə aydın görüntü verən boya ikinci şəxsə istifadə edilə bilən heç bir cavab verməyə bilər.

Əvəzedici seçməzdən əvvəl bu cümləni tamamlayın: “Mən ___ daxilində ___ müşahidə etməliyəm və hüceyrələr canlı qalmalıdır / canlı qalmasına ehtiyac yoxdur.” Bu cümlə boyanın yerinə yetirməli olduğu işi müəyyən edir.

Nümunədən və sualdan başlayın

Əvvəlcə hüceyrələrin canlı qalmalı olub-olmadığını müəyyən edin, sonra müşahidə etməli olduğunuz xüsusiyyəti seçin:

• Hüceyrələr canlı qalmalıdır: hərəkət və ya forma üçün boyasız faza-kontrast və ya DIC nəzərdən keçirin; nüvə DNT-si üçün flüoresansla Hoechst 33342 nəzərdən keçirin; membran bütövlüyü üçün SYTO 9 ilə propidium yodid kimi validasiya edilmiş analiz seçin.
• Hüceyrələrin canlı qalmasına ehtiyac yoxdur: bakterial morfologiya üçün kristal-violet sadə boyama və ya nigrozinlə neqativ boyama nəzərdən keçirin; Qram reaksiyası üçün tam Qram-boyama metodundan istifadə edin; fiksasiya edilmiş hüceyrələrdə nüvə DNT-si üçün DAPI flüoresansını nəzərdən keçirin.

Hər qolun məhdudiyyətlərini müqayisə etmək üçün bu cədvəldən istifadə edin. Bunlar mövcud protokolda flakonları bir-biri ilə əvəz etmək üçün təlimatlar deyil, metod seçimləridir.

Sadə yaxma üçün metodu ehtiyatla əvəz edin

Tapşırıq bakterial morfologiyanın birrəngli görünüşünü əldə etməkdirsə, kristal violet praktik namizəddir. FDA-nın Bakterioloji Analitik Təlimatında sadə boyama üçün uyğun iki kristal-violet formulasiyası göstərilir. Sənədləşdirilmiş formulasiyadan və onun hazırlanma metodundan istifadə edin; yalnız boyanın adı işlək reagenti müəyyən etmək üçün kifayət etmir.

Kristal violet Qram boyamasında da istifadə olunur, lakin bu, kristal-violet sadə boyamanı Qram boyamasına çevirmir. ASM Qram-boyama protokolunda diferensial nəticə kristal violet, yod, rəngsizləşdirmə və əks-boyamanın ardıcıl təsirindən asılıdır. Bu mərhələlərin buraxılması görüntünün nəyi müəyyən edə bildiyini dəyişir. Bu fərq üçün sadə boyama ilə Qram boyamasının müqayisəsinə baxın.

Nigrozin konturları göstərmək üçün fərqli yanaşma təklif edir: o, fonu tündləşdirir, bakterial hüceyrələr isə müqayisədə açıq qalır. Merck-in nigrozin təlimatlarında ümumi əvəzedicilər siyahısında nəzərdən qaça biləcək faydalı bir detal var. Göstərilən işlək formulasiyanın tərkibində formaldehid var. Buna görə də hüceyrələrin özü boyanmamış görünsə belə, “neqativ boyama” ifadəsindən onun canlı hüceyrələrlə uyğun olduğu nəticəsini çıxarmaq olmaz. Tam formulasiyanı və nümunənin hazırlanmasını yoxlayın.

Canlı nümunələr üçün optikanı dəyişməyi nəzərdən keçirin

Hüceyrələrin hərəkətini və ya bölünməsini izləmək istəyirsinizsə, başqa bir boyanın əlavə edilməsi müşahidəni çətinləşdirə bilər. Nikon-un şəffaf nümunələrdə kontrast təlimatında izah etdiyi kimi, faza-kontrast və diferensial interferensiya kontrastı, yəni DIC, nümunələri onların optik xüsusiyyətlərindəki fərqlər vasitəsilə görünən edir. Mikroskopda tələb olunan komponentlər olduqda onlar canlı, boyanmamış hüceyrələri göstərə bilər.

Bu seçim preparatı boyasız saxlayır, lakin əldə edilə bilən məlumatı dəyişir. Kontrastı hansı molekulun yaratdığını bilmədən sərhədi və ya hərəkəti izləyə bilərsiniz. Sual molekulyar lokalizasiya ilə bağlıdırsa, bunun əvəzinə uyğun işarələmə metodunu seçin.

Nüvə DNT-si üçün Invitrogen-in DAPI və Hoechst boyalarının müqayisəsi DAPI-nin fiksasiya edilmiş hüceyrələrdə geniş istifadəsini, daha yüksək hüceyrə keçiriciliyinə malik və canlı hüceyrələrin işarələnməsi üçün üstün tutulan Hoechst 33342-dən fərqləndirir. Hər ikisi flüoresans avadanlığı tələb edir. Heç biri rəngli işıqlı-sahə boyasının birbaşa əvəzi deyil.

Boya təsirini və işıqlandırmanı eksperimental şərtlər kimi qəbul edin. Ölçdüyünüz göstərici hüceyrələrin davranışıdırsa, boyanmış və boyanmamış preparatları müqayisə edin.

Qırmızı hüceyrə avtomatik olaraq ölü hüceyrə deyil

SYTO 9 və propidium yodid bakterial membran bütövlüyünü qiymətləndirmək üçün tez-tez birlikdə istifadə olunur. BacLight təlimatı bütöv membranları yaşıl boyanma, zədələnmiş membranları isə qırmızı boyanma ilə əlaqələndirir. Bu interpretasiya konkret nümunə üçün validasiya edilməlidir.

Rosenberg və həmkarlarının 2019-cu il tədqiqatı problemi nümayiş etdirir. Fosfat-buferli fizioloji məhlulda şüşə üzərində yetişdirilmiş 24 saatlıq E. coli biofilmlərində hüceyrələrin təxminən 96%-i yerində propidium-yodid-müsbət görünürdü. Bununla belə, müəlliflər nümunələr toplandıqdan sonra 82%-nin kultivasiya edilə bildiyini hesabladılar. Konfokal görüntülərdə qırmızı boyanmış materialın altında daxili hissəsi yaşıl olan hüceyrələr görünürdü ki, bu da yanıltıcı siqnalda hüceyrədənkənar nuklein turşularının rolunu göstərirdi.

Bu faizlər universal düzəliş əmsalını deyil, tədqiqat preparatlarında aparılmış fərqli ölçmələri təsvir edir. Faydalı nəticə siqnalın nədən yarandığını yoxlamaqdır. Biofilmdə nuklein turşusu boyası zədələnmiş hüceyrələrin daxilindəki materialla yanaşı, hüceyrələrin xaricindəki materialı da aşkar edə bilər. Canlılıq barədə nəticə çıxarmaq üçün tədqiqatçılar hər birinin öz məhdudiyyətləri olduğunu nəzərə almaqla kultivasiya və ya metabolik aktivlik kimi tamamlayıcı ölçmələr tövsiyə edirlər.

Alternativin əslində nədən ibarət olduğunu yoxlayın

Alternativ boyama metodunun tərkibində yenə də metilen mavisi ola bilər. Giemsa buna nümunədir: Merck öz məhsulunu qan və sümük iliyi yaxmaları daxil olmaqla müxtəlif tətbiqlər üçün nəzərdə tutulmuş azure-eosin-methylene-blue məhlulu kimi təsvir edir. Bu, fərqli nümunə üçün fərqli metod ola bilər, lakin metilen mavisinin istisna edilməsi tələbini ödəmir.

Birləşmənin istisna edilməsi eksperimentin bir hissəsidirsə, görüntüləri müqayisə etməzdən əvvəl reagentin kimliyini və formulasiyasını yoxlayın. Metil mavisi, metilen mavisi və oxşar adlanan boyalar haqqında təlimat adlandırmadakı fərqləri izah edir.

Nəticədən istifadə etməzdən əvvəl əvəzləməni yoxlayın

Yeni metod üçün reprezentativ nümunələrdən və uyğun nəzarət nümunəsindən istifadə etməklə kiçik müqayisə aparın. Mümkün olduqda mikroskop parametrlərini müqayisə edilə bilən saxlayın. Reagent formulasiyasını, nümunənin hazırlanmasını, məruz qalmanı və görüntüləmə şəraitini qeyd edin ki, daha yaxşı görünən görüntü sadəcə üstün tutulmaq əvəzinə araşdırıla bilsin.

Uğuru ilkin suala əsasən qiymətləndirin. Morfologiya üçün hüceyrə sərhədlərinin və düzülüşünün şərh edilə bilib-bilmədiyini qiymətləndirin. Nüvə işarələnməsi üçün siqnalın yerini və fonu qiymətləndirin. Canlılıq üçün cəlbedici rəng ayrılmasından əlavə sübut tələb edin. Metilen mavisi ilə boyama və laboratoriya tətbiqləri haqqında daha geniş təlimat müşahidə ilə preparatın bir-birinə necə uyğun gəldiyini izah edir.

Ehtiyacınız olan ölçməni qoruyan alternativi seçin. Rəng yaranan görüntünün yalnız bir xüsusiyyətidir.