Metilen mavisi və dağınıq skleroz: heyvan tədqiqatlarında nə sınaqdan keçirilib

MS üçün metilen mavisi haqqında axtarış etdikdə eyni suala cavab verirmiş kimi görünən məqalələr tapırsınız. Əslində isə belə deyil. Bir məqalədə xəstə siçanlara müalicə məqsədilə metilen mavisi verilib. Digərində isə heç bir heyvan onunla müalicə edilməyib. Patoloqun mikroskop altında mielini görə bilməsi üçün onurğa beyninin nazik kəsiklərində metilen mavisindən mavi boyaq kimi istifadə olunub.

Bütün məqalənin əsas məğzi budur. Bu boyağın biologiyada iki rolu var və eyni flakonda olmasından başqa onların ortaq cəhəti yoxdur. Dərman namizədi kimi canlı heyvana müəyyən dozada verilir və sual xəstəliyin dəyişib-dəyişməməsidir. Boyaq kimi isə təcrübədən sonra cansız, fiksasiya edilmiş toxumaya tətbiq olunur və sual toxumanın necə göründüyüdür. Bu fərqi nəzərdən qaçırsanız, patoloji tədqiqatın metodlar bölməsini müalicə nəticəsi kimi oxuyacaqsınız.

Sadə dillə EAE nədir

Adətən EAE kimi qısaldılan eksperimental autoimmun ensefalomielit dağınıq sklerozun müəyyən cəhətlərini öyrənmək üçün standart heyvan modelidir. Tədqiqatçı həssas siçanı mielin zülalının bir fraqmenti və güclü adyuvantla immunizasiya edir. Bundan sonra immun sistemi heyvanın öz mərkəzi sinir sisteminə hücum edir. Siçanda quyruqdan yuxarıya doğru yayılan zəiflik yaranır; bunu süst quyruqdan arxa ətrafların iflicinə qədər 0 ilə 5 arasındakı şkala üzrə qiymətləndirmək asandır.

Qiymətləndirmənin bu rahatlığı EAE-nin niyə geniş istifadə edildiyini, həm də niyə yanlış təsəvvür yarada bildiyini izah edir. İnsanlarda MS öz-özünə yaranır, daha geniş və daha az dəqiq müəyyən edilmiş hədəfləri əhatə edir və residivləşən və ya proqressiv gediş zamanı görmə, hissiyyat, koqnitiv, beyincik və hərəki simptomlar yaradır. EAE nəzarət edilən şəraitdə iltihab, demielinizasiya və akson zədələnməsi kimi seçilmiş mexanizmləri təkrarlayır. O, MS-in kiçildilmiş surəti deyil. Ümumi çərçivəni anlamaq istəyən oxucular hər hansı ayrıca xəstəlik iddiasını qiymətləndirməzdən əvvəl metilen mavisinin hüceyrə səviyyəsində necə təsir göstərdiyinin düşünüldüyünü nəzərdən keçirə bilərlər.

Aşağıdakı iki məqalədə fərqli EAE antigenlərindən də istifadə olunub və bu, əhəmiyyətlidir. Müalicə tədqiqatında xəstəlik mielin oliqodendrosit qlikoproteinindən alınmış qısa peptid olan MOG35-55 ilə yaradılıb. Patoloji tədqiqatda isə mielinin əsas zülalı və proteolipid zülal seqmentlərinin birləşməsi olan MP4 ilə yaradılıb. Siçan xətti və antigen seçimi zədələnmə ocaqlarının harada yarandığını və iltihabın necə getdiyini dəyişir. Buna görə bu iki tədqiqat eyni təcrübənin iki təkrarı deyil.

Xəritə: modeldən suala və məhdudiyyətlərə

Bu cədvəli açıq saxlayın. O, bu məqalənin əsas istinad çərçivəsidir. Hər sətir modelin hansı klinik suala cavab verə bildiyini, əslində nəyin ölçüldüyünü və nəticələrin insanlara tətbiqinin harada dayandığını göstərir.

Növbəti başlığı yoxlayan hər kəs klinikadan əvvəlki tədqiqatları necə oxumaq olar məqaləsinin köməyi ilə eyni sütunlardan istifadə edə bilər: növü və antigeni, birləşmənin rolunu, nəticə göstəricilərini və nəticənin xəstəliyin gedişini, yoxsa toxumanın müəyyən bir andakı vəziyyətini əks etdirdiyini soruşun.

Müalicənin nəticəsi: preparatın verilməsi nəyi dəyişdi

Journal of Neuroimmunology jurnalında dərc edilmiş 2016-cı il müalicə tədqiqatında təxminən 8 ilə 10 həftəlik dişi C57BL/6 siçanlarından istifadə olunub və hər siçan 250 mikroqram MOG35-55 ilə immunizasiya edilib. EAE yaradıldıqdan sonra heyvanlar təsadüfi qaydada metilen mavisi qrupuna və ya müalicə olunmayan EAE qrupuna bölünüb, klinik ballar isə təxminən 30-cu günə qədər izlənib.

15-ci gündən 30-cu günə qədər müalicə alan siçanların klinik balları EAE nəzarət qrupundakından statistik baxımdan əhəmiyyətli dərəcədə aşağı olub; P 0.01-dən kiçik olub. Onurğa beyninin analizi də eyni istiqaməti göstərib: müalicə alan heyvanlarda iltihabi infiltrasiya, demielinizasiya və akson itkisi daha az olub.

Tədqiqatı fərqləndirən cəhət siqnal ötürülməsi göstəriciləri toplusu idi. Müalicə AMPK aktivləşməsini və SIRT1 ekspressiyasını artırıb, iltihabın əsas tənzimləyicilərindən biri olan NF-kB-nin aktivləşməsini isə zəiflədib. Adaptiv immunitet baxımından Th17 cavabını azaldıb və Treg cavabını gücləndirib. Buna görə təklif olunan zəncir belədir: metilen mavisi → AMPK və SIRT1 → NF-kB siqnal ötürülməsinin azalması → iltihabi Th17-dən tənzimləyici Treg istiqamətinə dəyişiklik → daha yüngül toxuma zədələnməsi → daha aşağı ballar.

Bu zəncir sübut edilmiş səbəb-nəticə ardıcıllığı deyil, şərhdir. Tədqiqat preparatın verilməsinin, siqnal dəyişikliklərinin və xəstəliyin yaxşılaşmasının birlikdə baş verdiyini göstərir. AMPK və SIRT1-in faydanın hamısını təmin etdiyini sübut etmir. Açıq indekslənmiş mətndə isə kiloqrama düşən dəqiq milliqram dozası, tətbiq yolu, başlanğıc günü və müddət təkcə xülasəyə əsasən sxemi təkrarlamaq üçün kifayət qədər aydın göstərilmir. Satış səhifəsində bu məqalə ilə bağlı göstərilən hər hansı doza rəqəmini, tam mətnin metodlar bölməsinə istinad edilmirsə, təsdiqlənməmiş hesab edin. Bu ilkin immun siqnalın nə vaxtsa klinik məlumatlara çevrilib-çevrilmədiyini yoxlamaq üçün metilen mavisi haqqında insan tədqiqatlarından əldə edilmiş daha geniş sübut bazasına baxmaq lazımdır.

Patoloji nəticə: altı ay ərzində toxuma nə göstərdi

PLoS ONE jurnalında dərc edilmiş 2015-ci il MP4 tədqiqatında tam Freund adyuvantında 200 mikroqram MP4 ilə immunizasiya edilmiş dişi C57BL/6 siçanlarından istifadə olunub. İmmunizasiya günü və yenidən 48 saat sonra göyöskürək toksini də verilib. Heç bir heyvana dərman kimi metilen mavisi verilməyib. Fiksasiya və bloklara yerləşdirmədən sonra onurğa beyninin bir mikrometrlik eninə kəsikləri işıq mikroskopiyası üçün metilen mavisi ilə boyanıb; daha incə təfərrüatları görmək üçün isə ventrolateral yol elektron mikroskopiya ilə araşdırılıb.

Toxuma nümunələri üç mərhələdə götürülüb: kəskin zirvədə 7 siçandan, başlanğıcdan üç ay sonra 5 siçandan və başlanğıcdan altı ay sonra 10 siçandan. Bu mərhələlərdə orta klinik ballar demək olar ki, eyni görünüb: 0 ilə 5 arasındakı şkalada təxminən 1.7 ilə 1.8 arasında. Toxuma isə fərqli mənzərə göstərib. Yalnız mielini zədələnmiş liflərin sıxlığı kəskin zirvədə kvadrat millimetrə təxminən 569,000 lifdən altı ayda təxminən 1,496,000 lifə yüksəlib; kəskin mərhələ ilə uzunmüddətli mərhələnin müqayisəsində P 0.027-yə bərabər olub və fərq statistik baxımdan əhəmiyyətli olub. Mielin və aksonun birlikdə zədələnməsi altı ayda təxminən ikiqat artıb. Yenidən mielinləşən liflər hər mərhələdə bir faizdən aşağı qalıb; bu, bərpaya dair ümidlər baxımından ayıldıcı bir təfərrüatdır.

Akson zədələnməsi U formasında dəyişib: kəskin zirvədə yüksək, üç ayda daha aşağı, altı ayda isə ən yüksək olub. Bu zədələnmə mitoxondrilərin şişməsi və neyrofilamentlər arasındakı məsafənin azalması ilə əlaqəli olub. Qiymətləndirmə bal və mərhələ bilinmədən aparılıb. Bu, klinik balların davam edən struktur zədələnməsini tam əks etdirmədiyi şərhini gücləndirir.

Bu uyğunsuzluq tədqiqatın MS haqqında oxuyan şəxs üçün əsl töhfəsidir. Əlillik balının sabit qalması toxumanın vəziyyətinin sabit qalması demək deyildi. Bu həm də məqalənin metilen mavisi ilə MS müalicəsi barədə heç bir iddianı niyə dəstəkləyə bilmədiyini göstərir. O, müalicəni deyil, zamanın təsirini yoxlayıb.

Niyə heç bir tədqiqat xəstələrdə faydanı təsdiqləmir

Hər məqaləyə dar bir suala yaxşı cavab verən, xəstələrə aid suala isə ümumiyyətlə cavab verməyən iş kimi baxın.

Birincisi, səbəb fərqlidir. EAE müəyyən antigen və adyuvantla məqsədli şəkildə yaradılır. İnsanlarda MS T hüceyrələrini, B hüceyrələrini, anadangəlmə immuniteti və yerli qlial hüceyrələri əhatə edən daha geniş immun repertuarla öz-özünə inkişaf edir. Siçanda MOG-yönümlü cavabı dəyişən birləşmə insandakı daha geniş cavabı mütləq dəyişmir.

İkincisi, fenotip fərqlidir. Siçanda quyruqdan arxa ətraflara doğru yayılan zəiflik rahat ölçülən göstəricidir. O, insan MS-inin müxtəlifliyini bir hərəki rəqəmə sıxışdırır. Preparatlar insanlarda xəstəliyin gedişini dəyişmədən qısamüddətli EAE ballarını tez-tez dəyişir. Buna görə EAE kiçik bir klinika deyil, ilkin yoxlama və mexanizmləri öyrənmə vasitəsidir.

Üçüncüsü, preparata məruzqalma və zamanlama məsələləri aydınlaşdırılmayıb. 30 günlük siçan təcrübəsində erkən mərhələdən davamlı doza verilməsi artıq formalaşmış xəstəliyi olan insanda uzunmüddətli ağızdan istifadə ilə eyni deyil. Üstəlik, heç bir tədqiqat sinir sistemində preparat səviyyəsini ölçməyib. Bu əlaqə olmadan laboratoriya qabındakı konsentrasiyadan və ya siçana verilən dozadan insan üçün tətbiq sxeminə keçid yoxdur.

Dördüncüsü, bu iki məqalə bir-birini təkrarlamır. Antigenlər, suallar və nəticə göstəriciləri fərqlidir, birində isə ümumiyyətlə müalicə yoxdur. Onları birlikdə MS müalicəsi üzrə iki müsbət tədqiqat kimi təqdim etmək kateqoriyaları qarışdırmaqdır.

Sübutları qiymətləndirən oxucular üçün bu nə deməkdir

Bu məqalələrdə MS üçün təsdiqlənmiş metilen mavisi protokolu yoxdur. Müalicə tədqiqatı MOG EAE-də AMPK, SIRT1, NF-kB və Th17 ilə Treg arasındakı tarazlıq üzrə əlavə araşdırmaları dəstəkləyir. Patoloji tədqiqat xatırladır ki, ballar dəyişməz görünərkən toxuma zədələnməsi irəliləyə bilər və metodlar bölməsində metilen mavisi bəzən dərman dolabını deyil, boyaq qabını nəzərdə tutur. Davam edən dağınıq skleroz tədqiqatlarını izləyən oxucular boyaq ilə dərman arasındakı bu fərqi yadda saxlamalıdırlar. Kimsə laboratoriya nəticələri haqqında başlıqlara əsasən hərəkət etməzdən əvvəl qanla bağlı risklər və qarşılıqlı təsir riskləri də daxil olmaqla təhlükəsizlik məsələləri metilen mavisinin təhlükəsizliyinə dair ümumi məlumatlarla yanaşı klinisistlə müzakirə edilməlidir.

Yekun fikir bir cümləyə sığır. İstinad edilən tədqiqatlardan birində MOG EAE-li siçanlara metilen mavisi verilib və iltihabəleyhinə immun dəyişikliklə yanaşı daha yüngül xəstəlik bildirilib, digərində isə heç bir müalicə dozası verilməyib və altı ay ərzində yığılan mielin və akson zədələnməsi sənədləşdirilərkən metilen mavisindən yalnız onurğa beynini boyamaq üçün istifadə olunub; buna görə bu iki tədqiqat metilen mavisinin insanlarda MS-ə kömək etdiyini təsdiqləmir.