Metilen mavisi mitoxondrial Kompleks III-dən yan keçə bilərmi? Tədqiqatlar niyə fərqli nəticələr verir

İki laboratoriya metilen mavisinin bloklanmış mitoxondrial Kompleks III-dən yan keçib-keçə bilməyəcəyini araşdırdı. Biri xeyr cavabını verdi. Digəri bəli dedi. Hər ikisinin məlumatları var idi.

Siçan beyninin mitoxondrilərində aparılan ilk tədqiqat boyanın bunu edə bilmədiyini göstərdi. Üç gəmirici növünün beyin mitoxondrilərində aparılan ikinci tədqiqat isə bunu qismən edə bildiyini göstərdi. Siçan qaraciyərində aparılan üçüncü tədqiqat çox vaxt bu mövzu ilə yanaşı istinad edilir, amma başqa bir şeyi yoxlayıb. Onu düzgün kontekstdə saxlayanda qarışıqlığın yarısı aradan qalxır.

Burada elan ediləcək universal mexanizm yoxdur. Fərqli bloklayıcılar, dozalar və ölçmə göstəriciləri olan üç təcrübə var. Əvvəlcə şəraiti oxuyun. Nəticələr bundan sonra aydınlaşır.

Burada yan keçmə nə deməkdir

Elektronlar zəncirə Kompleks I (NADH-dan) və ya Kompleks II (suksinatdan) vasitəsilə daxil olur, Kompleks III-dən keçərək sitoxrom c-yə, sonra Kompleks IV-dən keçərək oksigenə çatır. Hüceyrə ATP yaratmaq üçün bu yol boyunca formalaşan qradiyentdən istifadə edir.

Yan keçmə iddiasına görə, metilen mavisi elektronları blokdan əvvəl götürüb blokdan sonra ötürür. Oksidləşmiş boya NADH-dan və ya zəncirin ilkin komponentlərindən elektron qəbul edərək leykometilen mavisinə çevrilir, reduksiya olunmuş forma isə onları sitoxrom c-yə və ya yenidən zəncirə ötürür. Ötürülmə blokdan sonra baş verirsə, tənəffüs və membran potensialı qismən bərpa olunur. Ötürülmə blokun özündə və ya ondan əvvəl baş verirsə, heç nə bərpa olunmur.

Kompleks III-ün bir xüsusiyyəti bu mübahisənin böyük hissəsini müəyyənləşdirir. Kompleks iki inhibitor bağlanma sahəsi olan Q dövrü ilə işləyir. Antimisin Qi sahəsinə bağlanır. Miksotiazol Qo sahəsinə bağlanır. Bunlardan yalnız birini istifadə edən tədqiqat kompleksin yalnız yarısını yoxlamış olur.

Birinci tədqiqat: siçan beyninin mitoxondrilərində yan keçmə yoxdur

Gureev və həmkarları C57BL/6 siçanlarının beyin qabığından digitoninlə izolyasiya edilmiş mitoxondrilərdən istifadə etdilər; sınaqlar hər ml-də 0.1 mg zülal konsentrasiyasında aparıldı. Substratlar üç rejimi əhatə edirdi: hər biri 5 mM olan piruvat və malat, 2 mM qlutamatla birlikdə 10 mM suksinat və 10 mM L-prolin. Bloklayıcılar 1 micromolar rotenon (Kompleks I) və hər ml-də 1 microgram antimisin (Kompleks III) idi. Boya dozaları 0.5, 1 və 2 micromolar idi, əsas konsentrasiya isə 1 micromolar götürülmüşdü. Metodlar və qeydə alınmış əyrilər FEBS Letters məqaləsində verilib.

Kompleks I-dən yan keçmə baş verdi. Rotenon ADP ilə stimullaşdırılmış tənəffüsü dəqiqədə hər mg üçün təxminən 121 nmol-dan təxminən 2 nmol-a endirdi, 1 micromolar boya isə onu təxminən 21-ə qədər bərpa etdi. Membran potensialı piruvat və malat, eləcə də L-prolin ilə bərpa olundu.

Kompleks III-dən yan keçmə baş vermədi. Antimisin tənəffüsü təxminən 16-ya endirdi, boya isə onu yalnız təxminən 20-yə qaldırdı. Boyanın 5 micromolar-a qədər dozalarında heç bir substratla membran potensialı bərpa olunmadı. Peroksid məlumatları da eyni nəticəyə işarə edirdi: təkcə boya peroksid buraxılmasını dəqiqədə hər mg üçün təxminən 76 pmol olan bazal sürətdən üç dozada müvafiq olaraq təxminən 1170, 1460 və 1945-ə qaldırdı, lakin antimisin boyanın yaratdığı bu siqnalı müvafiq olaraq təxminən 25, 88 və 96 faiz azaltdı. Reduksiya olunmuş boya birbaşa oksigenlə reaksiyaya girsəydi, Kompleks III-ün bloklanması siqnalı zəiflətməməli idi. Müəlliflər belə nəticəyə gəldilər ki, reduksiya olunmuş boya Kompleks III-ün Qo sahəsində, antimisin blokundan əvvəl oksidləşir. Qısa dövrə sözlə belədir: donorlardan boyaya, boyadan Qo-ya, sonra adi yolla irəli. Rotenondan yan keçilir. Antimisindən isə yox.

İkinci tədqiqat: üç növdə, hər iki inhibitor sahəsində qismən yan keçmə

Svab və həmkarları təcrübə planını genişləndirdilər. Siçan, siçovul və dəniz donuzlarının beyin mitoxondriləri Percoll ilə izolyasiya edildi və eyni konsentrasiyada, hər ml-də 0.1 mg olmaqla, hər biri 5 mM olan piruvat və malat və ya qlutamat və malat üzərində sınaqdan keçirildi. Onlar iki Kompleks III bloklayıcısından istifadə etdilər: 0.3 micromolar antimisin A və 1 micromolar miksotiazol. Əksər sınaqlarda boya 2 micromolar, sitoxrom c ilə aparılan işdə isə 0.5 idi. Uyğunlaşdırılmış protokollarla yoxlanmış hər üç növ açıq girişli məqalədə təqdim olunur.

Hər üç növdə hər iki blokdan qismən yan keçildi. Siçan mitoxondrilərində antimisin tənəffüsü zəiflətdi, boya isə onu təxminən 60 faiz artıraraq dəqiqədə hər mg üçün təxminən 37 nmol-dan 59 nmol-a qaldırdı. Miksotiazol onu 88 faiz azaldaraq təxminən 4.5-ə endirdi, boya isə beş dəfə artıraraq təxminən 23-ə qaldırdı. Hər iki inhibitorun təsiri altında membran potensialı qismən repolyarizasiya olundu; optik artefaktları istisna etmək üçün bu, iki boya ilə (safranin O və nisbət əsasında ölçmə aparan TMRM) ölçüldü.

Bu məqalədə elektronların ötürülməsi də birbaşa yoxlanıldı; birinci tədqiqatda bu edilməmişdi. 25 micromolar konsentrasiyada xaricdən əlavə edilmiş asetilləşdirilmiş sitoxrom c inhibitorların olub-olmamasından asılı olmayaraq enerji vəziyyəti saxlanılan mitoxondrilər tərəfindən reduksiya olunmadı, lakin boyanın əlavə edilməsi hər iki halda reduksiyanı təmin etdi. Hüceyrəsiz buferdə NADH və boya sitoxrom c-ni NADH miqdarına mütənasib sürətlə reduksiya etdi. Daha uzun keçid sözlə belədir: reduksiyaedici ekvivalentlərdən boyaya, boyadan birbaşa sitoxrom c-yə, Kompleks IV-dən oksigenə. Bu yol Kompleks III-ü tamamilə kənarda qoyur, buna görə də hər iki bloklayıcıdan yan keçmək mümkündür.

İki əlavə ölçmə göstəricisi bu izahı dəstəkləyir. Miksotiazolla işlənmiş mitoxondrilərə boya əlavə edildikdə NAD(P)H flüoressensiyası azaldı; bu, reduksiyaedici ekvivalentlərin yeni yol vasitəsilə sərf olunduğunu göstərirdi. Boyanın 660 nm-də absorbansı hər əlavədən sonra dəyişiklikləri ardıcıl əks etdirirdi, sentrifuqalanmış nümunələrin supernatantları isə oksidləşmiş boyanın enerji vəziyyəti saxlanılan mitoxondrilərin daxilində yüz dəfədən çox zənginləşdiyini, potensial çökəndə isə oradan çıxdığını göstərirdi. Proton balansı da buna uyğundur: protonların pompalanması mərhələlərindən yan keçmək hər elektron cütünə 10 əvəzinə təxminən 2 proton saxlayır. Buna görə də yalnız qismən repolyarizasiya ilə müşayiət olunan daha sürətli oksigen istifadəsi həqiqi yan keçmənin gözlənilən mənzərəsidir, onun əleyhinə dəlil deyil.

Eyni preparatda müşahidə olunan reaksiyalar səthi oxunuşu yanıltmağa kifayət edirdi. İnhibitor və boya birlikdə olduqda ADP tənəffüsü artırmaq əvəzinə azaldırdı, nəqlin bloklanması isə onu yavaşlatmaq əvəzinə stimullaşdırırdı; buna baxmayaraq, membran potensialı yenə adi istiqamətlərdə dəyişirdi. Bu sistemdə təkcə oksigen sərfinə baxmaq yanıltıcıdır.

Üçüncü tədqiqat: Kompleks III-ü deyil, Kompleks I və II-ni yoxlayan qaraciyər tədqiqatı

Lee və Boelsterli siçan qaraciyərinin mitoxondrilərindən və efavirenz (Kompleks I, IC50 təxminən 30 micromolar) və izoniazidin metaboliti olan hidrazin (Kompleks II, IC50 təxminən 30 micromolar) ilə zədələnmiş, kultivasiya olunmuş hepatositlərdən istifadə etdilər. Təxminən 30 micromolar boya oksidləşdiriciləri və nekrotik ölümü azaldarkən NADH oksidləşməsini, membran potensialını və ATP-ni bərpa etdi. Redox Biology məqaləsi bunu boyanın elektronları zədələnmiş Kompleks I və II-dən yan keçirərək daşıması kimi modelləşdirir.

Bu nəticə zəncirin əvvəlki hissəsinə aid təsdiqlənmiş kontekstdir və Kompleks III haqqında heç nə demir, çünki tədqiqatda həmin kompleksdə heç nə bloklanmamışdı. O, beyin mitoxondriləri üzrə tədqiqatların heç birini nə təsdiqləyə, nə də təkzib edə bilər.

Təcrübə şəraitinin matrisi

Kompleks III üzrə hər iki tədqiqatın öz təcrübə şəraiti üçün doğru ola bilməsinin dörd səbəbi

1. Bloklayıcı ilə müdaxilə eyni deyildi. Bir tərəfdə hər ml-də 1 microgram antimisin təkbaşına, digər tərəfdə isə 0.3 micromolar antimisin və ayrıca Qo sahəsi bloklayıcısı var idi. Elektronları Qo sahəsinə ötürən boya yolu, birbaşa sitoxrom c-yə ötürən yolun uğurlu olduğu şəraitdə uğursuz olur. Bir sahə hər ikisini təmsil edə bilməz.

2. Boya dozası və vaxt fərqli idi. Əsas konsentrasiyalar 1 və 2 micromolar idi; söhbət hüceyrəyə daxilolması və sitoxrom c-ni birbaşa reduksiya etməsi konsentrasiyadan və zamandan asılı olan redoks dövriyyəli maddədən gedir. Kiçik doza fərqləri ilə fərqli ölçmə vaxtları bir şəbəkənin müxtəlif qollarını üzə çıxara bilər.

3. Preparatlar fərqli idi. Digitoninlə izolyasiya ilə Percoll qradiyentində izolyasiya qismən üst-üstə düşən, lakin eyni olmayan mitoxondri populyasiyalarını seçir. Zülal konsentrasiyası hər ml-də 0.1 mg olmaqla eyni idi, buna görə bu dəyişən fərqi izah etmir, amma subpopulyasiya və bütövlük amilləri qalır. Növ fərqi ehtimalı da aradan qalxdı: ikinci qrup müşahidə etdiyi fenotipi siçanda da təkrarladı.

4. Substrat vəziyyəti boyanın nə edə biləcəyini müəyyənləşdirir. Bir tərəfdə üç substrat rejimi, digər tərəfdə NADH ilə əlaqəli cütlər var idi. NADH təchizatı və membran potensialı birlikdə boyanın nə qədər sürətlə reduksiya olunduğunu və harada paylandığını müəyyənləşdirir; oksidləşmiş sitoxrom c-nin yanında reduksiya olunmuş boyaya ehtiyacı olan yol isə bu seçimdən asılıdır.

Növbəti yan keçmə iddiasını necə oxumalı

Hansı kompleksin, hansı inhibitorla, hansı sahədə və hansı dozada bloklandığını soruşun. Boyanın konsentrasiyasını və ölçmənin nə vaxt aparıldığını soruşun. Toxumanı, növü, izolyasiya üsulunu, zülal konsentrasiyasını və substratı soruşun. Potensialın, tənəffüsün, redoks vəziyyətinin və birbaşa elektron ötürülməsi sınağının bir-birinə uyğun olub-olmadığını da soruşun, çünki burada təkcə oksigen sərfi bir neçə dəfə yanlış istiqamət göstərib.

Dar çərçivəli xülasə qüvvədə qalır. Boyanın Kompleks I-dən yan keçməsi barədə razılıq var. Kompleks III üçün isə hər ml-də 1 microgram antimisin və 1 micromolar boya ilə siçan mitoxondrilərində funksional yan keçmə müşahidə olunmur; 0.3 micromolar antimisin və ya 1 micromolar miksotiazol və 2 micromolar boya ilə üç növdə boyadan sitoxrom c-yə birbaşa ötürülmə ilə müşayiət olunan qismən yan keçmə müşahidə olunur. Bu cümlələr bir-birinə zidd deyil. Daha geniş hər hansı nəticə ekstrapolyasiyadır.

Əlaqəli oxu materialları mübahisəli iddianı mübahisəsiz kimyanın çərçivəsində saxlayır: elektron ötürülməsi üçün metilen mavisinin elektronları necə daşıdığı, zəncirin əvvəlki hissəsinə aid təsdiqlənmiş hal üçün Kompleks I-dən yan keçmə təcrübələri, iki boyanın niyə lazım olduğunu anlamaq üçün membran potensialının ölçmə göstəriciləri və onların artefaktları, doza və vaxtla bağlı tələləri anlamaq üçün isə redoks dövriyyəli maddələrlə laboratoriyada işləmə qaydaları.