Metilen mavisi və hüceyrə senesensiyası: fibroblast göstəricilərinin izahı

Geniş yayılmış yanlış şərh belə yaranır. Bir məqalədə metilen mavisinin kultivasiya olunan fibroblastlarda populyasiyanın ikiqat artımlarının sayını 20-dən çox artırdığı bildirilir. Oxucu isə bundan onun qocalmış hüceyrələri aradan qaldırdığı və ya insan ömrünü oxşar dərəcədə uzatdığı nəticəsini çıxarır. Bu nəticə təbii görünür. Amma iki ayrı məqamda yanlışdır.

Əsas problem rəqəmlərlə deyil, anlayışlarla bağlıdır. Populyasiyanın ikiqat artımları, senesensiya markerləri və telomer ölçmələri ayrı-ayrı suallara cavab verir. Metilen mavisi ilə bağlı fibroblast işlərini mitoxondrial ölçmələrlə dəstəklənən, laboratoriya qabında bir hüceyrə tipinin senesensiyaya keçidinin gecikməsini araşdıran tədqiqatlar kimi oxumaq daha doğrudur. Bu, artıq qocalmış hüceyrələrin seçici şəkildə aradan qaldırılmasından fərqlənir; hər ikisi də orqanizmin qocalmasından fərqlidir. Bu fərqin daha geniş konteksti mitoxondrial elektron daşınmasının hüceyrə enerjisini necə formalaşdırdığı və metilen mavisi tədqiqatları ilə bağlı iddiaların necə şərh edilməli olduğu ilə əlaqəlidir.

Populyasiyanın ikiqat artımları gəncliyi deyil, keçmişi sayır

Əsas nəticələrin çoxu məhdud replikativ qabiliyyətə malik normal insan dölünün ağciyər fibroblast ştamı olan IMR90 hüceyrələrindən əldə edilib. Metilen mavisi və IMR90 fibroblastlarının replikativ ömrü üzrə ilkin tədqiqatda kulturlar müəyyən qrafik üzrə pasaj edilib və kultur bölünməni dayandıranadək populyasiyanın kumulyativ ikiqat artımları qeydə alınıb. Əsasən 100 nM olmaqla nanomolyar səviyyələrdə tətbiq kulturların bölünməsi dayanana qədər 20-dən çox əlavə ikiqat artım toplamasına imkan verib.

Populyasiyanın ikiqat artımı bir uçot vahididir. O, populyasiyanın təxminən neçə dəfə ikiqat artdığını göstərir. Ayrı bir hüceyrənin senesensiya, müvəqqəti sakitlik, differensiasiya və ya ölüm vəziyyətində olub-olmadığını birbaşa bildirmir. Hüceyrələr bölünmə qabiliyyətini daha uzun müddət saxladığına, stress altında daha az hüceyrənin erkən dayanmasına və ya şəraitin çoxalma qabiliyyətli bir altpopulyasiyanı seçməsinə görə kultur daha çox ikiqat artım əldə edə bilər. Təkcə say bu yolları bir-birindən ayıra bilməz.

Buna görə ikiqat artım sayları markerlərlə birlikdə qiymətləndirilir. Say proliferasiyanın nə qədər davam etdiyini göstərir. Markerlər isə bölünməsi dayanmış və ya sağ qalmış hüceyrələrin hansı vəziyyətə keçdiyini göstərir.

Ölçmə göstəriciləri üzrə bələdçi: hər marker nəyi göstərir

Kulturda senesensiya bir neçə müstəqil ölçmə ilə müəyyənləşdirilən fenotipdir. Heç bir tək boyama və ya zülal onu sübut etmir.

DNA sintezinin itməsi ilə böyümənin dayanması. Davamlı dayanma BrdU və ya EdU-nun DNA-ya daxil olmasının azalması, yastı morfologiya və yenidən əkildikdən sonra böyümənin bərpa olunmaması ilə yoxlanılır. Bu, senesensiya ilə bağlı dayanmanı müvəqqəti sakitlikdən ayırır.

Senesensiya ilə əlaqəli beta-qalaktozidaza. SA-beta-gal boyaması pH 6.0 yaxınlığında lizosomal aktivliyi göstərir. Qocalmış fibroblastlarda lizosom kütləsi artdıqca boyama çox vaxt müsbət olur. Bu göstərici spesifik deyil, buna görə proliferasiya və molekulyar markerlərlə birlikdə şərh olunur.

p16 və p21 yolları. p16 CDK4, CDK6 və RB yolu vasitəsilə təsir göstərir. p21 çox vaxt p53 vasitəsilə induksiya olunur. Səviyyələrin artması dayanmanı dəstəkləyir, lakin bu zülalların heç biri yalnız senesensiyaya aid deyil.

Sekretor vəziyyət. Senesensiya ilə əlaqəli sekretor fenotip, yaxud SASP, sitokinlərin, xemokinlərin, böyümə amillərinin və proteazaların ifrazında dəyişiklikləri bildirir. SASP amilləri üçün RNA və ya zülal analizləri hüceyrələrin qonşu hüceyrələrə necə siqnal verdiyini təsvir edir. Onlar replikativ qabiliyyəti birbaşa ölçmür.

Oksidləşdiricilər və mitoxondrial göstəricilər. Metilen mavisi haqqında məqalələr mitoxondrial ölçmələr də əlavə edir: kompleks IV-ün miqdarı və aktivliyi, oksigen istehlakı, hem sintezi, membran kütləsi, membran potensialı, ATP və oksidləşdirici siqnallar. Bunlar dayanmanın gecikməsi ilə müşayiət olunan metabolik vəziyyəti təsvir edir. Öz-özlüyündə senesensiyanı müəyyənləşdirməsələr də, təklif olunan mexanizmi yoxlayırlar. NAD(P)H-ın metilen mavisini reduksiya etdiyi və sitoxrom c-nin onu yenidən oksidləşdirdiyi redoks dövrü modeli həmin redoks dövrünü oksidləşdirici istehsalının azalması ilə əlaqələndirən IMR90 tədqiqatında izah olunur. Müvafiq doza və paylanma məntiqi metilen mavisinin farmakologiyası və toxumaların ona məruz qalması mövzusunda əhatə olunur.

Telomer qısalma sürəti. Düzgün ölçü vahidi bir zaman nöqtəsindəki uzunluq deyil, həftələr ərzində hər ikiqat artıma düşən itirilmiş baza cütlərinin sayıdır. Daha yavaş qısalma hər replikasiyada daha az qısalma deməkdir. Bu, uzanma demək deyil və stress telomerlərdə az dəyişikliklə IMR90 hüceyrələrinin bölünməsini dayandıra bilər.

Üç fibroblast tədqiqat dizaynının müqayisəsi

Bu səhifə üçün hazırlanmış əsas material aşağıdakı müqayisədir. O, hüceyrə tipini, məruz qalmanı, ölçməni və məhdudiyyəti bir baxışda birləşdirir.

Tədqiqat	Hüceyrələr və məruz qalma	Nə ölçülüb	Nəyi göstərə bilməz
Atamna və b., FASEB J 2008	Normal IMR90 fibroblastları, uzunmüddətli nanomolyar metilen mavisi tətbiqi, standart şərait kimi 100 nM	Kumulyativ ikiqat artımlar, kompleks IV miqdarı, oksigen istehlakında 37–70 faiz artım, hem sintezi, hidrogen peroksid və ya kadmiumun yaratdığı vaxtından əvvəl senesensiyanın qarşısının alınması, HepG2 hüceyrələrində faza 2 fermentləri	Qocalmış hüceyrələrin aradan qaldırılması yoxlanılmayıb. Heyvanlarda və ya insanlarda uzunömürlülük göstəricisi yoxdur. Burada replikativ ömür laboratoriya qabındakı ikiqat artımlar deməkdir.
Atamna və b., Redox Biology 2015, AMPK və kompleks IV biogenezi üzrə mexanizmləri araşdıran davam tədqiqatında təsvir olunub	IMR90 fibroblastları, əsasən 100 nM metilen mavisi, müqayisə üçün uzunmüddətli AMPK aktivatoru kimi AICAR	NAD-ın NADH-a nisbətinin zamanla dəyişməsi, keçici AMPK fosforlaşması, PGC-1alpha və SURF1 induksiyası, kompleks IV aktivliyində 100 faizdən çox artım, oksidləşdiricilərin 28 faiz azalması, daha yavaş telomer qısalması, AICAR ilə təxminən 2 əlavə ikiqat artıma qarşı təxminən 18 əlavə ikiqat artım, hüceyrə siklinə təsirin olmaması	AICAR ilə müqayisədə doza təxminən 1000 dəfə, spesifiklik isə ayrıca fərqlənir; buna görə müqayisə uyğunlaşdırılmış təsir gücünü deyil, aktivləşmə modelini yoxlayır. Telomer nəticəsi həftələr ərzində bölünən kulturlara aiddir.
Xiong və b., Aging Cell 2016, mitoxondrial və nüvə göstəricilərinin bərpasını araşdıran progeriya fibroblastları tədqiqatında bildirilib	Birincili Hutchinson-Gilford progeriyası dəri fibroblastları və uyğun normal kontrol hüceyrələri, əsasən 5–12 həftə ərzində 100 nM	Flüoresans və elektron mikroskopiyası ilə mitoxondrial forma, canlı görüntüləmə ilə hərəkətlilik, superoksid, membran potensialı, ATP, PGC-1alpha, proliferasiya və senesensiya markerləri, həmçinin nüvə qabarcıqları, progerinin lokalizasiyası, heteroxromatin və gen ifadəsi	Normal qocalma deyil, xəstəliyə xas vaxtından əvvəl qocalma modelidir. Morfologiyanın və markerlərin bərpası qocalmış hüceyrələrin aradan qaldırılması deyil. Heyvanlarda effektivlik və ya klinik nəticə göstəricisi yoxdur.
Xue və b., Cells 2021 icmalı, metilen mavisinin qocalma əleyhinə namizəd birləşmə kimi nəzərdən keçirildiyi icmalda ümumiləşdirilib	Beyin qocalması, neyrodegenerasiya, dəri, yara sağalması və progeriya ədəbiyyatının sintezi	Metilen mavisini kompleks I və III-dəki elektron axınının bəzi hissələrindən yan keçə bilən katalitik redoks dövrü iştirakçısı kimi təqdim edir və bunu qocalmanın sərbəst radikal nəzəriyyələri kontekstində nəzərdən keçirir	Yalnız təsviri sintezdir. Fərziyyələri sistemləşdirir və klinik sübutların harada qeyri-qəti qaldığını qeyd edir.

Sətirlər üzrə ümumi mənzərə hər hansı bir ayrıca sətirdən daha vacibdir. Aşağı dozalı metilen mavisi təkrarən daha uzun proliferasiya müddəti, daha yüksək kompleks IV aktivliyi, daha aşağı oksidləşdirici siqnallar və yaxşılaşmış morfologiya ilə əlaqələndirilir. Dizayn uzunmüddətli müşahidəyə əsaslanır: bölünən hüceyrələrlə başlanır, çoxalma zamanı maddə tətbiq olunur və bölünmənin nə qədər davam etdiyi qeydə alınır. Bu quruluş gecikdirmə iddiasını dəstəkləyə bilər. Fərqli dizayn olmadan aradan qaldırma iddiasını dəstəkləyə bilməz.

Senesensiyanı gecikdirmək qocalmış hüceyrələri aradan qaldırmaq deyil

Gecikdirmə bölünən hüceyrələrin dayanmadan əvvəl daha uzun müddət bölünməyə davam etməsi deməkdir. Çox vaxt senolitik təsir adlandırılan aradan qaldırma isə artıq qocalmış hüceyrələrin seçici şəkildə öldürülməsi və ya sayının azaldılması, çoxalan qonşu hüceyrələrin isə sağ qalması deməkdir.

Metilen mavisi üzrə fibroblast ədəbiyyatı birinci quruluşu yoxlayır. Kulturlar başlanğıcda çoxalır, ardıcıl pasajlar zamanı maddəyə məruz qalır və bölünmələri daha gec dayanır. Buna görə SA-beta-gal, p16, p21 və SASP amilləri kimi markerlər daha gec görünür və ya müəyyən pasajda daha aşağı səviyyədə olur. Başlanma vaxtı dəyişdikdə belə bir mənzərə gözləniləndir. Bu, artıq senesensiya vəziyyətinə keçmiş hər hansı hüceyrənin aradan qaldırıldığını sübut etmir.

Senolitik təsir iddiası fərqli quruluş tələb edərdi: əvvəlcə kulturda təsdiqlənmiş senesensiya yaradılmalı, sonra birləşmə tətbiq olunmalı, daha sonra isə canlılıq və ölümün birbaşa ölçülməsi ilə həmin qocalmış hüceyrələrin çoxalan kontrol hüceyrələrinə nisbətən seçici itkisi göstərilməlidir. Təkcə markerin azalması kifayət deyil, çünki hüceyrə itkisi olmadan ifadə dəyişə bilər və qalan çoxalan hüceyrələr qabı doldura bilər. İstinad edilən dörd mənbənin heç biri metilen mavisi üçün bu seçici azaltma dizaynından istifadə etmir. Buna görə düzgün təsvir senolitik təsir deyil, in vitro senesensiyanı gecikdirən və ya senesensiya əleyhinə aktivlik olaraq qalır. Bu fərqin oksidləşdirici stress tərəfi hüceyrələrin reaktiv oksigen növlərini necə nəzarətdə saxladığı haqqında məqalədə daha ətraflı izah olunur.

Keçici siqnallaşma nəticəsi bu məqamı daha da aydınlaşdırır. 2015-ci il IMR90 işində metilen mavisi NAD-ın NADH-a nisbətində qısamüddətli artım və qısamüddətli AMPK fosforlaşması yaradıb, ardınca kompleks IV biogenezi ilə əlaqəli PGC-1alpha və SURF1 induksiyası baş verib. AICAR ilə uzunmüddətli AMPK aktivləşməsi əlavə ikiqat artımlar baxımından xeyli zəif nəticə göstərib.

Replikativ ömür insan uzunömürlülüyü deyil

Hüceyrənin replikativ ömrü oksigeni, qida mühiti və pasaj ritmi sabit saxlanılan nəzarətli laboratoriya qabında bölünmə dayanana qədərki ikiqat artımları sayır. İnsan uzunömürlülüyü isə onilliklər boyu inkişafı, immuniteti, damar sistemini, kök hüceyrə nişlərini, davranışı və xəstəlikləri birləşdirir. Bir birləşmə ikincini dəyişmədən birincini uzada bilər və əksəriyyəti məhz belə edir.

Progeriya fibroblastları progerin əmələ gətirən müəyyən LMNA mutasiyası daşıyır; onlarda parçalanmış və daha az hərəkətli mitoxondrilər, aşağı ATP, formasını itirmiş nüvələr və heteroxromatin itkisi müşahidə olunur. Nanomolyar metilen mavisi mitoxondrial göstəriciləri yaxşılaşdırıb və progerinin membrandan ayrılması da daxil olmaqla nüvə göstəricilərini əhəmiyyətli dərəcədə bərpa edib. Bu, hüceyrə səviyyəsində diqqətəlayiq bərpadır. Yenə də fibroblast nəticəsi olaraq qalır və müəlliflər heyvanlarda sınaqları gələcək iş kimi göstəriblər. Xəstəlik modelinin özü progeriya və vaxtından əvvəl qocalma modellərində metilen mavisi haqqında məqalədə daha ətraflı müzakirə olunur.

Bundan praktik oxu üçün aşağıdakı yoxlama siyahısı çıxır.

Maddənin tətbiqinə bölünmə dayanmadan əvvəl, yoxsa dayanma artıq formalaşdıqdan sonra başlanıldığını soruşun. Əvvəl başlanması gecikdirməni dəstəkləyir. Aradan qaldırma üçün sonradan tətbiq və seçici ölüm məlumatları tələb olunur.
Kontrol qrupunun ikiqat artım əyrisinin necə dəyişdiyini soruşun. Kumulyativ ikiqat artımlar olmadan marker dəyişiklikləri kontekstdən qopur.
Tək boyama əvəzinə ən azı iki marker sinfi tələb edin; məsələn, proliferasiya nişanı ilə yanaşı p16 və ya p21, üstəlik SA-beta-gal.
Telomerlərin necə təqdim edildiyini soruşun. Zaman ərzində hər ikiqat artıma düşən qısalma sürəti məna daşıyır. Tək bir anda ölçülmüş uzunluq isə bunu vermir.
Nələrin sabit saxlanıldığını soruşun. Pasaj sıxlığı, oksigen, qida mühitinin dəyişdirilməsi, eləcə də təzə və ya saxlanılmış metilen mavisi ehtiyat məhlulları fibroblastların bölünməsinin dayanmasına təsir edir.

Bu şəkildə oxunduqda fibroblast ədəbiyyatı metilen mavisinə ardıcıl, lakin məhdud bir rol verir: kultivasiya olunan insan fibroblastlarında replikativ senesensiyanı gecikdirən və eyni zamanda mitoxondrial göstəriciləri yaxşılaşdıran aşağı dozalı, redoks-aktiv birləşmə. Ən güclü mexanistik təfərrüatlar keçici enerji siqnallaşması və kompleks IV biogenezi ilə bağlıdır; bu məqalələrdə isə qocalmış hüceyrələrin aradan qaldırılması və ya insan ömrünün uzadılması göstərilmir.