Metilen mavisi və ferroptoz: lipid peroksidləşməsi mexanizmi

Ferroptoz membranın zədələnməsi nəticəsində baş verən hüceyrə ölümüdür. Membranlardakı çoxdoymamış yağlar zəncirvari reaksiya ilə oksidləşir, membran funksiyasını itirir və hüceyrə ölür. Bu kimyəvi proses üçün dəmir lazımdır. Bütün anlayış bu cümlədə ifadə olunur və bu məqalədəki hər şey onun bir hissəsini yoxlayır.

Buradakı sual daha konkretdir: hüceyrə təcrübələrində metilen mavisi bu zəncirə necə təsir edir və alınan nəticə əslində nəyi göstərir? Qısa cavab budur ki, iki laboratoriya tədqiqatında nanomolyar konsentrasiyalı metilen mavisi mitoxondrial lipid peroksidləşməsini azaldıb və normalda ferroptoza səbəb olan təsirlərdən sonra hüceyrələrin sağ qalmasını təmin edib. Daha geniş cavab isə daha vacibdir, çünki zəncirin hər halqası fərqli müdaxilə ilə yoxlanılıb və hər müdaxilənin öz məhdudiyyətləri var.

Bir abzasda ferroptoz

Çoxdoymamış yağ turşusu quyruğu daşıyan membran fosfolipidinin zəif nöqtəsi var: asanlıqla qoparıla bilən hidrogen atomları. Radikal belə bir atomu qopardıqda lipidə oksigen birləşir, lipid peroksil radikalı yaranır və bu radikal növbəti lipiddən hidrogen qoparır. Nəsə onu dayandırmayınca reaksiya membran boyunca yayılır.

Əsas dayandırıcı mexanizm GPX4 adlı fermentdir. O, qlutationdan istifadə edərək lipid peroksidlərini zərərsiz lipid spirtlərinə qədər reduksiya edir. Laboratoriyada istifadə olunan təhrikedici maddələr bu müdafiəni konkret nöqtələrdə hədəfə alır. Erastin xc-minus sistemi vasitəsilə sistinin hüceyrəyə daxil olmasını bloklayır və hüceyrəni qlutation sintezi üçün lazım olan sisteindən məhrum edir. Butionin sulfoksimin qlutation sintezini birbaşa bloklayır. RSL3 isə GPX4-ün özünü inhibə edir. Hər üç halda peroksidlər aradan qaldırılmır, lakin bu, fərqli mərhələlərdə baş verir. Buna görə bir təhrikedici maddə ilə əldə edilən nəticə avtomatik olaraq digərlərinə şamil edilə bilməz.

Ferroptoz onu müəyyən edən xüsusiyyətlərə görə apoptozdan fərqlənir. Burada nə kaspaza kaskadı, nə də apoptotik cisimciklər olur. Deferoksamin kimi dəmir xelatorları və ferrostatin-1 kimi radikalları tutan maddələr onu basqılayır. Tədqiqatçılar ölümü sadəcə nekrotik deyil, ferroptotik adlandırmaq üçün bu praktik meyardan istifadə edirlər. Tənzimlənən hüceyrə ölümü yollarının daha geniş mənzərəsi bu fərqi anlamağa kömək edir, hüceyrələrin labil dəmirlə necə davrandığı isə xelatlaşmanın niyə belə həlledici nəzarət üsulu olduğunu izah edir.

Mitoxondrilərin rolu və bunun niyə mübahisə doğurduğu

İlkin tədqiqatlarda mitoxondrial DNT-si olmayan hüceyrələrin də ferroptoza uğradığı bildirilmişdi. Bu, mitoxondrilərin zəruri olmadığını düşündürürdü. Sonrakı tədqiqatlarda isə mitoxondrilərin sayının azaldılmasının və ya tənəffüsün bloklanmasının sistein çatışmazlığından yaranan ferroptozu basqılaya bildiyi, lakin GPX4-ün birbaşa inhibəsi nəticəsində yaranan ferroptozu basqılamadığı aşkarlandı. Mitoxondrilərin töhfəsi təhrikedici təsirdən, hüceyrə tipindən və həlledici peroksidləşmənin baş verdiyi yerdən asılıdırsa, hər iki nəticə doğru ola bilər.

Bu məqalənin əsaslandığı tədqiqat mübahisəyə hüceyrənin konkret bölməsinə yönəlmiş zondla yanaşdı. MitoCLox lipid peroksidləşməsini göstərən indikatorun mitoxondrilərə hədəflənmiş versiyasıdır: mitoxondrilərin daxilində lipid peroksil radikalları ilə qarşılaşdıqda onun flüoressensiyası dəyişir. Erastinlə işlənmiş fibroblastlarda mitoxondrial zondun oksidləşməsi hələ canlı hüceyrələrdə, ölümdən əvvəl müşahidə olunurdu və hüceyrə populyasiyası boyunca qeyri-bərabər idi. Bu zaman ardıcıllığı vacibdir. Ölümdən əvvəl baş verən peroksidləşmə mümkün səbəbdir. Yalnız ölü hüceyrələrdə ölçülən peroksidləşmə isə prosesin qalığıdır. Lipid peroksidləşməsi analizləri və hər zondun nəyi göstərdiyi haqqında əlaqəli bələdçi zondun yerləşdiyi yerin siqnalın mənasını niyə müəyyən etdiyini izah edir.

Eyni mənzərə ikinci modeldə də müşahidə olundu. Leber irsi optik neyropatiyası olan pasiyentdən alınmış, I kompleksdə mutasiya daşıyan və ilkin oksidləşdirici stress səviyyəsi daha yüksək olan fibroblastlar qlutation tükəndikdə ferroptoz nəticəsində öldü, nəzarət fibroblastları isə buna davam gətirdi. Mitoxondrial zondun oksidləşməsi yenə əvvəl baş verdi. Təfərrüatlar fibroblastlarda ferroptoz zamanı mitoxondrial lipid peroksidləşməsi tədqiqatında verilir.

Bu təcrübələrdə metilen mavisi nəyi dəyişdi

Metilen mavisi oksidləşmə-reduksiya daşıyıcısıdır. Onun oksidləşmiş forması I kompleksdə NADH ilə əlaqəli kimyəvi proseslərdən elektronları qəbul edir, reduksiya olunmuş forması isə onları IV kompleksə ötürən sitoxrom c-yə verir. Bu, zəncirin elektronların adətən oksigenə sızaraq superoksid yaratdığı hissəsi ətrafında qismən yan keçid yaradır. Elektronların ötürülməsinin tam mənzərəsini anlamaq istəyən oxucular metilen mavisinin elektronları mitoxondrilər boyunca necə daşıdığı ilə başlamalıdırlar.

Erastinlə işlənmiş ağciyər fibroblastlarında 250 nanomolar konsentrasiyalı metilen mavisi, mitoxondrilərə hədəflənmiş SkQ1 və MitoTEMPO antioksidantları ilə yanaşı, hüceyrələrin sağqalma testində canlılığı qorudu. İddianın sərhədlərini nəzarət sınaqları müəyyən edir. Ferrostatin-1, alfa-tokoferol və deferoksamin də qoruyucu təsir göstərdi; bu, ölümün ferroptotik olduğunu təsdiqləyir. Antioksidant qrupu olmayan SkQ1 analoqu qoruyucu təsir göstərmədi. Bu isə qeyri-spesifik toplanmaya deyil, oksidləşmə-reduksiya proseslərinə işarə edir. SkQ1 konsentrasiyası təxminən 200 nanomolar həddini keçdikdə qoruyucu təsir zəiflədi. Bu, xinon antioksidantlarının daha yüksək miqdarlarda məlum prooksidant davranışına uyğundur. Metilen mavisi də dozadan asılı olaraq bu cür ikili davranır: bu kulturlarda aşağı nanomolyar səviyyələrdə qoruyucu təsir göstərir, konsentrasiyası artırıldıqda və ya güclü işıqlandırıldıqda isə oksidləşmə-reduksiya dövrləri vasitəsilə hidrogen peroksid yarada bilir. Bu cür konsentrasiya konteksti mitoxondrilərdə reaktiv oksigen növləri haqqında məqalədə izah olunur.

Daha sonra təcrid olunmuş mitoxondrilərlə aparılan təcrübələr ROS mənbələrini bir-birindən ayırdı. İkivalentli dəmirin iştirakı ilə I kompleksi qidalandıran substratlar rotenonla birlikdə zondun oksidləşməsini stimullaşdırdı. Rotenon flavin sahəsindən sonrakı hissəni bloklayır. Buna görə əvvəlki daşıyıcılar reduksiya olunmuş vəziyyətdə qalır və elektronlar matriksə baxan flavindən oksigenə sızır. III kompleksi qidalandıran substratlar antimisin A ilə birlikdə çoxlu hidrogen peroksid yaratdı, lakin lipid peroksidləşməsinə səbəb olmadı. Ümumi ROS siqnalı eyni, məkan fərqli, nəticə isə başqa idi. Həm SkQ1, həm də metilen mavisi hidrogen peroksid istehsalının özünü basqılamadan I kompleksin səbəb olduğu peroksidləşməni basqıladı. Bu, onların təsirinin ROS yaranmasından sonra, lipid peroksidləşməsi mərhələsində olduğunu göstərir.

Dəmirlə həddindən artıq yüklənmə istiqaməti və lipofussin ipucu

İkinci tədqiqat sualı dəmir baxımından araşdırdı. Submillimolyar konsentrasiyalı dəmir(III) ammonium sitratın təsirinə məruz qalan H9c2 kardiomiositlərində əvvəlcə mitoxondrial ROS, sonra mitoxondrial lipid peroksidləşməsi və ferroptoz yarandı; ardınca 24 saat ərzində lipofussinə bənzər piqment toplandı. Lipofussin oksidləşmiş lipid və zülalların yaş artdıqca toplanan, dəmir tərkibli, autoflüoressent qalığıdır. Onun burada sürətlə yaranması dəmirin səbəb olduğu kəskin peroksidləşməni klassik qocalma markeri ilə əlaqələndirir. Nanomolyar konsentrasiyalı metilen mavisi və SkQ1 ayrı-ayrılıqda peroksidləşmənin, ölümün və piqment toplanmasının qarşısını aldı. Təcrid olunmuş ürək mitoxondriləri bu mənzərəni təsdiqlədi: rotenon ikivalentli dəmirlə birlikdə peroksidləşməyə və piqmentə bənzər siqnala səbəb oldu, hər iki maddə isə bunu blokladı. Tam ardıcıllıq H9c2 kardiomiositlərində dəmirlə həddindən artıq yüklənmə tədqiqatında təqdim olunur. Mövzunun piqmentlə bağlı tərəfi lipofussin və hüceyrə qocalması markerləri ilə birlikdə nəzərdən keçirilməlidir.

Hüceyrələrin sağqalma testləri nəyi göstərmir

CellTiterBlue kimi canlılıq testi təhrikedici təsir və potensial qoruyucu maddə tətbiq edildikdən sonra qabda neçə hüceyrənin metabolik cəhətdən aktiv qaldığını göstərir. Bu, müəyyən edilmiş sistemdə bir mexanizmin sınağıdır. Müalicə nəticəsi deyil. Bu təcrübələrin heç birində pasiyentə doza verilməyib, xəstəliklə bağlı son göstərici ölçülməyib və ya orqanizmdə terapevtik interval müəyyən edilməyib.

Dörd məhdudiyyət açıq şəkildə qeyd edilməlidir. Birincisi, hüceyrə tipləri məhduddur: transformasiya olunmuş ağciyər fibroblastları, mitoxondrial xəstəliklə əlaqəli bir hüceyrə xətti də daxil olmaqla ilkin dəri fibroblastları və siçovul kardiomiosit xətti, həmçinin təcrid olunmuş siçovul ürəyi mitoxondriləri. Həssaslıq hüceyrə xəttindən asılı olaraq dəyişirdi və LHON xətti tədqiqatın quruluşuna görə qeyri-adi dərəcədə həssas idi. İkincisi, təhrikedici təsirlər laboratoriyaya xas ifrat şərait yaradır: daşınmanın və ya sintezin tam bloklanması, eləcə də heç bir toxumanın kəskin şəkildə məruz qalmayacağı dəmir yükləri. Üçüncüsü, konsentrasiyanı sadəcə vurma əməliyyatı ilə insan dozasına çevirmək olmaz. Kultura mühitindəki nanomolyar konsentrasiya insan dozası deyil. Metilen mavisinin paylanması, qanda və toxumalarda rəngsiz formasına reduksiya olunması, işığa məruz qalma və membran potensialı laboratoriya qabı ilə insan arasındakı bütün fərqlərə daxildir. Dördüncüsü, zondlar yalnız öz yerləşdikləri bölmə barədə məlumat verir. MitoCLox-un oksidləşməsi mitoxondrial lipid radikallarının yarandığını göstərir; ehtimal olunan son hadisə olan plazma membranının parçalanmasının əvvəlki mərhələlərə təsir hesabına deyil, birbaşa qarşısının alındığını göstərmir.

Beləliklə, dürüst iddia budur: bu modellərdə I kompleksdən yaranan ROS dəmirlə birlikdə ferroptozdan əvvəl baş verən mitoxondrial lipid peroksidləşməsinə səbəb olur və aşağı konsentrasiyalarda metilen mavisi bu mərhələni kəsir. Bu mərhələdən kənara çıxan hər bir iddia əvvəlcə heyvanlarda, sonra isə insanlarda fərqli təcrübələr tələb edir.