Metilen mavisi antioksidant və prooksidant kimi: nəticəni nə dəyişir?

Tutaq ki, iki laboratoriya eyni mavi boyanı sınaqdan keçirir və bir-birinə zidd nəticələr bildirir. Birincidə təcrid olunmuş beyin mitoxondrilərinin tənəffüsü yaxşılaşır və onlar daha çox ATP istehsal edir. İkincidə isə eyni preparat xeyli çox hidrogen peroksid buraxır. Hər iki hesabat doğrudur. Onlar eyni dövrün iki tərəfdən görünüşünü təsvir edir; çaşqınlıq isə oxucular bir tərəfi bütün mənzərə kimi qəbul etdikdə başlayır.

Səhv molekula hansı etiketin uyğun gəldiyini soruşmaqdadır. Onun hüceyrə biologiyasındakı hədəflərinin xəritəsində daha geniş kontekstdə göstərildiyi kimi, metilen mavisi elektronları ötürən vasitəçidir. Oksidləşmiş boya elektronları qəbul edir və rəngsiz leucoMB-yə çevrilir. LeucoMB bu elektronları ötürərək yenidən mavi rəng alır. Müşahidə etdiyiniz nəticə elektronları kimin verdiyindən, kimin qəbul etdiyindən və sistemin bu prosesdə yaranan hidrogen peroksidi aradan qaldıra bilib-bilməməsindən asılıdır. Verməyə dəyər sual heç vaxt boyanın antioksidant olub-olmaması deyil. Sual şəraitin bu ötürmə mexanizminə nə etməyə imkan verməsidir.

Hər iki tərəfi yaradan dövr

Qaranlıqda əsas dövr qısadır. NADH, NADPH və ya tənəffüs zəncirindəki daşıyıcılar boyanı reduksiya edir. Bundan sonra reduksiya olunmuş boya üçün bir-biri ilə rəqabət aparan yollar yaranır. O, elektronları sitoxrom c-yə ötürərək zədələnmiş kompleksi yan keçən axını dəstəkləyə bilər; buna görə kompleks I və ya III blokadası zamanı tənəffüs və membran potensialı qismən bərpa olunur. Yaxud elektronları birbaşa oksigenə ötürə bilər; bu, mavi formanı bərpa edir və hidrogen peroksid yaradır. Boya yenidən bərpa olunduğuna görə onun az miqdarı bu dövrü dəfələrlə təkrarlaya, davamlı olaraq reduksiya ekvivalentlərini sərf edə və peroksid yarada bilər.

Daha iki qol kimyanı tamamilə dəyişir. Sərbəst mis və ya dəmir Fenton tipli reaksiyalar vasitəsilə diffuziya edə bilən həmin peroksidi daha dağıdıcı yerli oksidantlara çevirir. Qırmızı işıq ayrıca fotokimyəvi qol açır: həyəcanlanmış boya enerjini oksigenə ötürür və sinqlet oksigen yaradır. Bu növ I tip və II tip fotokimyanın izahında ətraflı nəzərdən keçirilir. Qaranlıqda redoks dövrü, metalların gücləndirdiyi zədələnmə və fotodinamik zədələnmə eyni başlanğıc molekulunu paylaşan üç fərqli mexanizmdir.

Şərait və nəticə matrisi

Aşağıdakı cədvəli əl altında saxlamağa dəyər. Hər sətir bir dəyişəni, onun nəticəni hansı istiqamətə yönəltdiyini və bunu göstərən təcrübəni təqdim edir. Müsbət nəticə qoruyucu təsir və ya yaxşılaşmış göstərici deməkdir. Mənfi nəticə daha çox oksidant, daha çox tükənmə və ya daha çox zədələnmə deməkdir.

Əsas məqam sətirlər arasında görünən qanunauyğunluqdur. Peroksid istehsalı və bioloji qorunma ayrı qiymətləndirmə oxlarıdır. Bir müdaxilə eyni vaxtda birincidə mənfi, ikincidə isə müsbət nəticə göstərə bilər.

Niyə eyni doza fərqli cavablar verir

Konsentrasiya elektron daşıma tutumunu müəyyən edir, son nəticəni yox. Bütöv beyin mitoxondriləri üzrə tədqiqatda beyin mitoxondrilərindən peroksid buraxılması 50 nM-dən başlayaraq ölçülə bilən dərəcədə artdı, qaranlıqda aşkar mitoxondrial DNT zədələnməsi üçün isə 100 uM tələb olundu. Bu, ilk siqnal ilə genotoksiklik arasında təxminən iki min qat fərqdir, lakin təhlükəsizlik həddi deyil. Ölçülən son göstəricilər, hüceyrə bölmələri və məruzqalma müddətləri fərqləndiyindən bu rəqəmlər eyni əyri üzərindəki nöqtələri deyil, ayrı hadisələri göstərir. Doza-cavab müzakirəsi aşağı siqnal ilə yüksək zədələnmə arasındakı bu cür fərqi daha geniş hormezis kontekstində yerləşdirir.

Substrat elektronların haradan daxil olduğunu müəyyən edir. NADH ilə əlaqəli enerji substratları boyanı həm faydalı yan keçid, həm də israfçı oksigen reaksiyası üçün bol reduksiya ekvivalentləri ilə təmin edir. Suksinatın boyanı antioksidanta, qlutamatın isə prooksidanta çevirdiyi barədə tez-tez sitat gətirilən xülasə məlumatlardan həddindən artıq nəticə çıxarır. Çünki ürək tədqiqatında suksinatla peroksidin ölçüldüyü şəraitdə rotenon da mövcud idi və bütün substratlarda və tənəffüs vəziyyətlərində peroksidin artdığını aşkar edən beyin tədqiqatından fərqli toxuma və doza istifadə olunmuşdu.

İşıq yalnız təsirin miqyasını deyil, mexanizmi dəyişir. Bu topludakı ən aydın müqayisə qaranlıqda 20 uM konsentrasiyanın mitoxondrial DNT fraqmentlərinə ölçülə bilən təsir göstərməməsi, qırmızı işıq altında isə 20 uM konsentrasiyanın onların hamısını zədələməsidir. İşıqlı şəraitdə aparılan təcrübəni qaranlıqda aparılan təcrübə ilə müqayisə edən hər kəs fotokimyanı redoks dövrü ilə müqayisə edir.

Metallar oksidantı başqa formaya çevirir. Metallar olmadan boyanın qaranlıqdakı dövrü peroksid yaradır; bu, hüceyrələrin siqnal kimi də istifadə etdiyi, diffuziya edə bilən molekuldur. Reaksiyaya girə bilən mis və ya dəmir olduqda NADH ilə reduksiya olunmuş boya metalın reduksiyasını təmin edir, reduksiya olunmuş metal isə DNT-nin yanında peroksidi hidroksil tipli və ya mis-peroksid növlərinə çevirərək aktivləşdirir. NADH və metal ionları ilə hüceyrəsiz tədqiqatda eyni başlanğıc boyadan həm tez-tez mutasiyaya uğrayan sahələrə seçici, həm də geniş DNT zədələnməsi belə yarandı. Bu qolun əhəmiyyətli olub-olmadığını təkcə boya deyil, həmin bölmədə metalların necə idarə olunduğu müəyyən edir.

Enerji substratlarının mövcudluğu hüceyrənin bu xərci ödəyə bilib-bilmədiyini müəyyən edir. 2 ilə 20 uM arasında boya konsentrasiyasına məruz qalmış endotel hüceyrələrində qlükozanın çıxarılması oksidant yükünü üzə çıxardı, qlükoza təchizatı isə onu aradan qaldırdı; halbuki qlükoza boyanın reduksiyasını da sürətləndirirdi. Müdafiə ehtiyatları təmin olunmuş daha sürətli dövr, müdafiə ehtiyatları tükənmiş daha yavaş dövrdən üstündür. Qlükoza və ya NADPH vəziyyətini qeyd etməyən hər bir oksidant iddiasını natamam sayın.

Toxuma mövcud mexanizmləri müəyyən edir. Endotel hüceyrələri qlükoza metabolizmi vasitəsilə NADPH-ni bərpa edir və sitozolda antioksidant ehtiyatlarına malikdir. Təcrid olunmuş mitoxondrilərdə bunların heç biri yoxdur. Təmizlənmiş DNT-də hətta təmir mexanizmləri də yoxdur. Bir preparatda alınmış nəticə digərləri barədə çox az məlumat verir; buna görə toxumaya xas cavablar haqqında planlaşdırılan məqalədə bu sistemləri ayrı saxlamaq lazım gələcək.

Birbaşa ölçmə sonrakı müdafiə reaksiyası deyil

Bir çox yazı təcrübələrin ayrı saxladığı iki səviyyəni birləşdirir. Bir səviyyə nə qədər oksidant yarandığını soruşur. Digəri hüceyrənin buna necə cavab verdiyini araşdırır.

Amplex tipli peroksid analizləri birinci səviyyəyə ən yaxındır, lakin onlar da xalis axını göstərir: istehsaldan parçalanma və xaricə daşınma çıxılır. Beyin mitoxondriləri üzrə tədqiqat hər iki tərəfdə dəyişiklik aşkar etdi: daha çox peroksid yarandı və əlavə edilmiş birdəfəlik peroksid miqdarının aradan qaldırılması yavaşladı. Daha sonrakı mərhələlərdə qlutationun oksidləşməsi, askorbatın sərfi, oksidləşmiş quanin və polimerazanı bloklayan DNT zədələnmələri yer alır. Hər addım oksidant ilə ölçülən göstərici arasına əlavə bioloji proseslər qoyur.

Nrf2-nin idarə etdiyi antioksidant fermentlər və mitoxondrial biogenez ikinci səviyyədədir. Bunlar zəif peroksid impulsunun işə sala biləcəyi uyğunlaşma proqramlarıdır. Beyin mitoxondrilərinin qorunması üzrə tədqiqatın müəllifləri məhz belə zəif stresin başladıcı rolunu təklif edir, eyni zamanda Nrf2 üzərindən keçən səbəb-nəticə zəncirinin özlərinin tam sübutuna deyil, əvvəlki tədqiqatlara əsaslandığını qeyd edirlər. Yeni zülallar sayəsində saatlar sonra yaranan qorunma başlanğıc kimyəvi prosesin antioksidant olması demək deyil. Bu, kiçik prooksidant hadisənin daha böyük müdafiəyə zəmin yaratması deməkdir. Belə iddiaları oxuyarkən nəzərə alınmalı çərçivələr, o cümlədən analizlərin məhdudiyyətləri və preparatlar arasındakı fərqlər metilen mavisi tədqiqatlarını oxumaq üçün bələdçinin mövzusudur.

Niyə analizlər bir-biri ilə razılaşmır

Dihidroflüoresein kimi ümumi zond peroksid konsentrasiyasını deyil, zondun ümumi oksidləşməsini göstərir. Bu, peroksidaza və hem kimyasından asılıdır və kalibrlənmiş Amplex analizinin aşkar etdiyi peroksid artımını gözdən qaçıra bilər. Beyin mitoxondriləri üzrə tədqiqat uyğun superoksid siqnalı olmadan peroksidin kəskin artdığını müşahidə etdi; bu, boya əsaslı hər hansı tək antioksidant iddiasına istinad etməyə qarşı xəbərdarlıqdır. Optik üst-üstə düşmə yoxlanmalı əsaslı məsələdir, çünki boya görünən işığı geniş istifadə olunan həyəcanlanma və emissiya zolaqlarının yaxınlığında udur. Lakin diqqətlə aparılmış tədqiqat məlum peroksid miqdarlarına görə kalibrləmə etdi, siqnalda çox az dəyişikliklə həyəcanlandırıcı işığa məruzqalmanı azaltdı və ayrıca elektrodla peroksidin daha yavaş aradan qaldırıldığını təsdiqlədi. Ölçməyə müdaxilə yoxlanmalı amildir, nəticəni avtomatik rədd etmək üçün əsas deyil.

Kalsium nəticəsi də eyni dəqiqlik ehtiyacını göstərir. Diabetə yönəlmiş ürək mitoxondriləri tədqiqatında boyanın qısamüddətli təsiri keçiricilik keçidindən əvvəl ümumi kalsium yükünü dəyişmədi, lakin bloklanmış beyin mitoxondrilərində kalsium qəbulunun sürətini yaxşılaşdırdı. Fərqli son göstəricilər, fərqli sistemlər — ziddiyyət yoxdur.

Yekun qənaətə etibar etməzdən əvvəl yoxlama siyahısı

Hər bir antioksidant və ya prooksidant qənaətini müəyyən sistem haqqında hesabat kimi qəbul edin və beş sual verin. Hansı konsentrasiyada və hansı bölmədə? Hansı elektron donoru və onunla rəqabət aparan hansı akseptorla? İşıqda, yoxsa qaranlıqda; hansı dalğa uzunluğunda və dozada? Hansı metallar reaksiyaya girə bilir və enerji substratları ilə antioksidant ehtiyatları nə dərəcədə təmin olunub? Və hansı analizlə — oksidant axını, zədələnmə, yoxsa uyğunlaşma cavabı ölçülür? Cavablardan hər hansı birini dəyişin və eyni molekul heç bir paradoks olmadan matrisdə qoruyucu mövqedən zədələyici mövqeyə keçə bilər.