প্ৰবন্ধ
মাইক্ৰস্কপিৰ বাবে মিথিলিন ব্লুৰ বিকল্প: কাম অনুসৰি বাছনি কৰক
সাধাৰণ বেক্টেৰিয়াৰ স্মিয়াৰৰ ক্ষেত্ৰত, যদি লক্ষ্য কোষৰ আকৃতি দেখা হয়, তেন্তে মিথিলিন ব্লুৰ ঠাইত ক্ৰিষ্টেল ভায়োলেট ব্যৱহাৰ কৰিব পাৰি। জীৱিত কোষৰ ক্ষেত্ৰত, অধিক উপযুক্ত বিকল্প হ’ব পাৰে একেবাৰে কোনো ৰং নকৰাকৈ ফেজ কনট্ৰাষ্ট। আপুনি কোনটো পৰ্যবেক্ষণ কৰিব বিচাৰে, তাৰ ওপৰত বাছনি নিৰ্ভৰ কৰে।
ধৰি লওক, দুজন ব্যক্তিয়ে একেটা বেক্টেৰিয়াৰ কালচাৰ পৰীক্ষা কৰিছে। এজনৰ লক্ষ্য দণ্ডাকাৰ কোষক ঘূৰণীয়া কোষৰ পৰা পৃথক কৰা। আনজনে জানিব বিচাৰে কোনো ট্ৰিটমেণ্টে বেক্টেৰিয়াবোৰ মাৰি পেলাইছে নে নাই। প্ৰথমজনক স্পষ্ট ছবি দিয়া এটা ৰঙে দ্বিতীয়জনক ব্যৱহাৰযোগ্য কোনো উত্তৰ নিদিবও পাৰে।
বিকল্প বাছনি কৰাৰ আগতে এই বাক্যটো সম্পূৰ্ণ কৰক: “মই ___-ত ___ পৰ্যবেক্ষণ কৰিব লাগিব, আৰু কোষবোৰ জীৱিত হৈ থাকিব লাগিব / নালাগে।” এই বাক্যই ৰংটোৱে কৰিবলগীয়া কামটো নিৰ্ধাৰণ কৰে।
নমুনা আৰু প্ৰশ্নৰ পৰা আৰম্ভ কৰক
প্ৰথমে সিদ্ধান্ত লওক কোষবোৰ জীৱিত হৈ থাকিব লাগিব নে নাই, তাৰ পিছত আপুনি পৰ্যবেক্ষণ কৰিবলগীয়া বৈশিষ্ট্যটো চিনাক্ত কৰক:
- কোষবোৰ জীৱিত হৈ থাকিব লাগিব: গতি বা আকৃতিৰ বাবে ৰং নকৰা ফেজ কনট্ৰাষ্ট বা DIC বিবেচনা কৰক; নিউক্লিয়াৰ DNA-ৰ বাবে ফ্লুৰ’চেন্সৰ সৈতে Hoechst 33342 বিবেচনা কৰক; মেমব্ৰেনৰ অখণ্ডতাৰ বাবে SYTO 9 আৰু propidium iodide-ৰ দৰে বৈধতা প্ৰমাণিত assay বাছনি কৰক।
- কোষবোৰ জীৱিত হৈ থাকিব নালাগে: বেক্টেৰিয়াৰ মৰ্ফ’লজিৰ বাবে ক্ৰিষ্টেল-ভায়োলেট simple stain বা nigrosin negative stain বিবেচনা কৰক; Gram reaction-ৰ বাবে সম্পূৰ্ণ Gram-stain পদ্ধতি ব্যৱহাৰ কৰক; স্থিৰ কৰা কোষত নিউক্লিয়াৰ DNA-ৰ বাবে DAPI fluorescence বিবেচনা কৰক।
প্ৰতিটো শাখাৰ সীমাবদ্ধতা তুলনা কৰিবলৈ এই তালিকাখন ব্যৱহাৰ কৰক। এইবোৰ পদ্ধতি বাছনিৰ বিকল্প, কোনো বৰ্তমান প্ৰট’কলৰ ভিতৰত বটল সলনি কৰাৰ নিৰ্দেশ নহয়।
| আপুনি কি পৰ্যবেক্ষণ কৰিব লাগিব | নমুনা আৰু সঁজুলি | সম্ভাব্য বিকল্প | মুখ্য সীমাবদ্ধতা |
|---|---|---|---|
| বেক্টেৰিয়াৰ আকৃতি আৰু বিন্যাস | প্ৰস্তুত কৰা বেক্টেৰিয়াৰ স্মিয়াৰ; brightfield | Crystal violet simple stain | মৰ্ফ’লজি দেখুৱায়; Gram reaction বা viability প্ৰতিষ্ঠা নকৰে। |
| অন্ধকাৰ পটভূমিৰ বিপৰীতে কোষৰ সীমাৰেখা | বেক্টেৰিয়’লজিকেল প্ৰস্তুতি; brightfield | Nigrosin negative stain | প্ৰস্তুতি আৰু formulation গুৰুত্বপূৰ্ণ; ৰং নলগা কোষ মানেই জীৱিত কোষ নহয়। |
| Gram reaction | প্ৰস্তুত কৰা বেক্টেৰিয়াৰ স্মিয়াৰ; brightfield | সম্পূৰ্ণ Gram-stain পদ্ধতি | সম্পূৰ্ণ reagent sequence আৰু controls প্ৰয়োজন। |
| জীৱিত কোষৰ গতি বা পৰিৱৰ্তন | উপযোগী wet preparation; phase contrast বা DIC | কোনো stain নহয় | উপযুক্ত optics প্ৰয়োজন; contrast-এ কোনো molecule চিনাক্ত নকৰে। |
| Nuclear DNA | স্থিৰ কৰা কোষ; fluorescence | DAPI | উপযোগী excitation আৰু emission filters প্ৰয়োজন। |
| জীৱিত কোষৰ Nuclear DNA | জীৱিত কোষ; fluorescence | Hoechst 33342 | কোষত প্ৰৱেশ কৰাটোৱে imaging conditions ক্ষতিহীন বুলি প্ৰতিষ্ঠা নকৰে। |
| বেক্টেৰিয়াৰ membrane integrity | স্থিৰ নকৰা বেক্টেৰিয়া; fluorescence | SYTO 9 with propidium iodide | Membrane staining viability-ৰ এটা পৰোক্ষ মাপ। |
সাধাৰণ স্মিয়াৰৰ বাবে পদ্ধতিটো সাৱধানে সলনি কৰক
বেক্টেৰিয়াৰ মৰ্ফ’লজিৰ একৰঙী দৃশ্য প্ৰয়োজন হলে ক্ৰিষ্টেল ভায়োলেট এটা ব্যৱহাৰিক বিকল্প। FDA-ৰ Bacteriological Analytical Manual-এ simple staining-ৰ বাবে উপযোগী দুটা crystal-violet formulation তালিকাভুক্ত কৰিছে। নথিভুক্ত formulation আৰু তাৰ preparation method ব্যৱহাৰ কৰক; কেৱল dye-টোৰ নামেই এটা কাৰ্যকৰ reagent নিৰ্ধাৰণ নকৰে।
Gram staining-তো crystal violet ব্যৱহাৰ হয়, কিন্তু সেইবাবে crystal-violet simple stain এটা Gram stain নহয়। ASM Gram-stain protocol-ত differential result-টো crystal violet, iodine, decolorization আৰু counterstaining-এ ক্ৰমে কাম কৰাৰ ওপৰত নিৰ্ভৰ কৰে। সেই ধাপবোৰ বাদ দিলে ছবিখনে কি প্ৰতিষ্ঠা কৰিব পাৰে সেয়া সলনি হয়। এই পাৰ্থক্যৰ বাবে simple staining আৰু Gram staining-ৰ তুলনা চাওক।
Nigrosin-এ সীমাৰেখা প্ৰকাশ কৰাৰ এটা বেলেগ উপায় দিয়ে: ই পটভূমি গাঢ় কৰে, আনহাতে বেক্টেৰিয়াৰ কোষবোৰ তুলনামূলকভাৱে পাতল দেখা যায়। Merck-ৰ nigrosin নিৰ্দেশনা-ত এনে এটা উপযোগী তথ্য আছে যিটো সাধাৰণ বিকল্পৰ তালিকাত বাদ পৰিব পাৰে। তেওঁলোকৰ নিৰ্দিষ্ট working formulation-ত formaldehyde অন্তৰ্ভুক্ত। সেয়েহে কোষবোৰ নিজে ৰং নলগা দেখা গ’লেও কেৱল “negative stain” শব্দৰ পৰা live-cell compatibility অনুমান কৰিব নোৱাৰি। সম্পূৰ্ণ formulation আৰু specimen preparation পৰীক্ষা কৰক।
জীৱিত নমুনাৰ বাবে optics সলনি কৰাৰ কথা বিবেচনা কৰক
যদি আপুনি কোষ চলাচল কৰা বা বিভাজিত হোৱা চাব বিচাৰে, আন এটা dye যোগ কৰিলে পৰ্যবেক্ষণ জটিল হ’ব পাৰে। Nikon-এ স্বচ্ছ নমুনাত contrast সম্পৰ্কীয় গাইডত ব্যাখ্যা কৰা মতে, phase contrast আৰু differential interference contrast, অৰ্থাৎ DIC, নমুনাৰ optical properties-ৰ পাৰ্থক্যৰ সহায়ত সিহঁতক দৃশ্যমান কৰে। মাইক্ৰস্কপত প্ৰয়োজনীয় components থাকিলে এই পদ্ধতিবোৰে জীৱিত, ৰং নকৰা কোষ দেখুৱাব পাৰে।
এই বাছনিয়ে preparation-টো ৰং নকৰাকৈ ৰাখে, কিন্তু উপলব্ধ তথ্য সলনি কৰে। কোন molecule-এ contrast সৃষ্টি কৰিছে সেয়া নজনাকৈও আপুনি কোনো boundary বা movement অনুসৰণ কৰিব পাৰে। যদি molecular localization-য়েই প্ৰশ্ন হয়, তেন্তে উপযুক্ত labeling method বাছনি কৰক।
Nuclear DNA-ৰ বাবে Invitrogen-ৰ DAPI আৰু Hoechst stains-ৰ তুলনা-ই fixed cells-ৰ সৈতে DAPI-ৰ সাধাৰণ ব্যৱহাৰক অধিক cell-permeant Hoechst 33342-ৰ পৰা পৃথক কৰে; live-cell labeling-ৰ বাবে Hoechst 33342 অধিক পছন্দ কৰা হয়। দুয়োটাৰ বাবেই fluorescence equipment প্ৰয়োজন। কোনোটোৱেই ৰঙীন brightfield stain-ৰ প্ৰত্যক্ষ বিকল্প নহয়।
Dye exposure আৰু illumination-ক experimental conditions হিচাপে গণ্য কৰক। যদি কোষৰ আচৰণেই আপোনাৰ measurement হয়, তেন্তে stained আৰু unstained preparations তুলনা কৰক।
ৰঙা কোষ মানেই স্বয়ংক্ৰিয়ভাৱে মৃত কোষ নহয়
বেক্টেৰিয়াৰ membrane integrity মূল্যায়নৰ বাবে SYTO 9 আৰু propidium iodide প্ৰায়ে একেলগে ব্যৱহাৰ কৰা হয়। BacLight manual-এ অখণ্ড membrane-ৰ সৈতে সেউজীয়া staining আৰু ক্ষতিগ্ৰস্ত membrane-ৰ সৈতে ৰঙা staining সংযোগ কৰে। এই ব্যাখ্যা সংশ্লিষ্ট specimen-ৰ বাবে validate কৰা প্ৰয়োজন।
Rosenberg আৰু সহকৰ্মীসকলৰ 2019 চনৰ এটা অধ্যয়ন-এ সমস্যাটো দেখুৱায়। phosphate-buffered saline-ত glass-ৰ ওপৰত 24-hour E. coli biofilms-ত প্ৰায় 96% কোষ in situ propidium-iodide-positive দেখা গৈছিল। কিন্তু harvest কৰাৰ পিছত লেখকসকলে 82% cultivable বুলি অনুমান কৰিছিল। Confocal images-ত ৰঙা ৰঙেৰে ৰঞ্জিত পদাৰ্থৰ তলত সেউজীয়া ভিতৰভাগ থকা কোষ দেখা গৈছিল, যিয়ে বিভ্ৰান্তিকৰ signal-টোত extracellular nucleic acids জড়িত থকাৰ ইংগিত দিছিল।
এই শতাংশবোৰে অধ্যয়নটোৰ preparations-ত কৰা পৃথক measurements বৰ্ণনা কৰে; এইবোৰ কোনো universal correction factor নহয়। উপযোগী শিক্ষা হ’ল signal-টো কিহে সৃষ্টি কৰিলে সেয়া পৰীক্ষা কৰা। Biofilm-ত nucleic-acid dye-এ ক্ষতিগ্ৰস্ত কোষৰ ভিতৰৰ পদাৰ্থৰ লগতে কোষৰ বাহিৰৰ পদাৰ্থও চিনাক্ত কৰিব পাৰে। Viability-ৰ সিদ্ধান্তৰ বাবে গৱেষকসকলে cultivation বা metabolic activity-ৰ দৰে পৰিপূৰক measurements ব্যৱহাৰৰ পৰামৰ্শ দিয়ে, লগতে প্ৰতিটোৰেই সীমাবদ্ধতা আছে বুলি স্বীকাৰ কৰে।
বিকল্পটোৰ ভিতৰত আচলতে কি আছে পৰীক্ষা কৰক
বিকল্প staining method-তো methylene blue থাকিব পাৰে। Giemsa তাৰ এটা উদাহৰণ: Merck-এ তেওঁলোকৰ product-ক azure-eosin-methylene-blue solution হিচাপে বৰ্ণনা কৰিছে, যিটো blood আৰু bone-marrow smears-সহ বিভিন্ন application-ৰ বাবে উদ্দেশ্য কৰা হৈছে। ভিন্ন specimen-ৰ বাবে ই ভিন্ন method হ’ব পাৰে, কিন্তু methylene blue বাদ দিয়াৰ প্ৰয়োজন পূৰণ নকৰে।
যদি কোনো compound বাদ দিয়াটো experiment-ৰ এটা অংশ হয়, তেন্তে images তুলনা কৰাৰ আগতে reagent identity আৰু formulation পৰীক্ষা কৰক। methyl blue, methylene blue আৰু একেধৰণৰ নাম থকা dyes সম্পৰ্কীয় গাইডত নামকৰণৰ পাৰ্থক্য আলোচনা কৰা হৈছে।
ফলাফল ব্যৱহাৰ কৰাৰ আগতে substitution-টো verify কৰক
নতুন method-ৰ বাবে representative specimens আৰু উপযুক্ত control ব্যৱহাৰ কৰি সৰু এটা তুলনা কৰক। সম্ভৱ হ’লে microscope settings তুলনাযোগ্য ৰাখক। Reagent formulation, specimen preparation, exposure আৰু imaging conditions নথিভুক্ত কৰক, যাতে কেৱল অধিক ভাল দেখা বুলি পছন্দ কৰাৰ পৰিৱৰ্তে ভাল দেখা image-টোৰ কাৰণ অনুসন্ধান কৰিব পাৰি।
মূল প্ৰশ্নটোৰ বিপৰীতে সফলতা মূল্যায়ন কৰক। Morphology-ৰ বাবে cell boundaries আৰু arrangement ব্যাখ্যা কৰিব পৰা অৱস্থাত আছে নে নাই মূল্যায়ন কৰক। Nuclear labeling-ৰ বাবে signal location আৰু background মূল্যায়ন কৰক। Viability-ৰ বাবে কেৱল আকর্ষণীয় color separation-তকৈ অধিক প্ৰমাণ দাবী কৰক। methylene blue staining আৰু laboratory applications সম্পৰ্কীয় বিস্তৃত গাইডত observation আৰু preparation কেনেদৰে একেলগে সম্পৰ্কিত হয় সেয়া ব্যাখ্যা কৰা হৈছে।
আপোনাৰ প্ৰয়োজনীয় measurement অক্ষুণ্ণ ৰখা বিকল্পটো বাছনি কৰক। ৰং ফলত পোৱা image-টোৰ বহু বৈশিষ্ট্যৰ মাত্ৰ এটাহে।