الميثيلين الأزرق وبارتونيلا: النتائج المخبرية وحدود الأدلة السريرية

يشترك طبق الزرع والمريض في كلمة واحدة، وهي العدوى، لكن ليس في المفهوم نفسه. في الطبق، العدوى هي عدد المستعمرات على الآغار. أما في المريض، فهي بكتيريا داخل الخلايا والأوعية، وأدوية تتحرك عبر الدم والأنسجة، وجهاز مناعي يؤدي جزءًا من العمل. الخلط بين الاثنين يجعل رقمًا مخبريًا لافتًا يبدو كأنه علاج. أما الفصل بينهما فيجعل الرقم كما هو: سببًا لإجراء التجربة التالية.

هذا الفصل هو جوهر هذه المراجعة حول الميثيلين الأزرق وبارتونيلا. اختبرت دراستان مخبريتان من مجموعة بحثية واحدة الميثيلين الأزرق ضد بارتونيلا هينسيلي في حالات غير نامية. أبلغت كلتاهما عن نشاط قوي في الزجاج والبلاستيك. ولم تختبر أي منهما شخصًا.

لماذا يختبر الباحثون الطور الساكن

تستخدم معظم اختبارات المضادات الحيوية خلايا نامية. يفوّت هذا النموذج حالة أصعب: الخلايا التي توقفت عن الانقسام وتتحمل الأدوية التي تقتل نظيراتها النامية.

يمكن لبارتونيلا أن تبقى في الجسم، بما في ذلك داخل كريات الدم الحمراء والخلايا البطانية. لذلك سأل الفريق أي الأدوية المعتمدة يمكنها قتل B. henselae بعد دخولها الطور الساكن. لم يتنبأ MIC منخفض ضد الخلايا النامية بقتل الطور الساكن. كان للريفامبين MIC منخفض جدًا لكنه قتل الخلايا الساكنة بشكل ضعيف، بينما قتلت مركبات ذات قيم MIC أعلى هذه الخلايا جيدًا. القراء الذين يريدون طريقة عامة لقراءة هذا النوع من الأبحاث سيجدونها في الدليل الخاص بقراءة أبحاث الميثيلين الأزرق.

الفحص الأول: Li وزملاؤه، 2019

استخدم فحص الطور الساكن لعام 2019 في Antibiotics سلالة واحدة، وهي B. henselae JK53، نُمّيت في وسط Schneider مع 10 بالمائة من مصل الجنين البقري عند 37 C مع 5 بالمائة من CO2. كانت مزارع اليوم الواحد في الغالب خلايا منقسمة ومبعثرة. أما مزارع اليوم الخامس، عند نحو 10 إلى القوة 8 من وحدات تكوين المستعمرات لكل مل، فاعتُبرت طورًا ساكنًا واحتوت على تجمعات مرئية.

كان الاختبار باستخدام SYBR Green I مع يوديد البروبييديوم، وتمت معايرته مقابل خلطات من الخلايا الحية والخلايا المقتولة بالأيزوبروبانول. ولأن الميثيلين الأزرق ذو لون قوي، تم تأكيد النتائج الإيجابية بالمجهر ثم بعدّ المستعمرات على آغار الدم، وهو نقطة النهاية الأكثر صرامة.

من بين 1,581 دواءً معتمدًا بتركيز 50 ميكرومولار، ترك الميثيلين الأزرق نسبة بقاء 16 بالمائة بواسطة قارئ الصفائح و25 بالمائة بواسطة المجهر. سجل دابتومايسين 21 بالمائة، وسجلت عدة أزولات 22 إلى 27 بالمائة، وجنتاميسين 32 بالمائة، وإريثرومايسين 66 بالمائة، وسيبروفلوكساسين 74 بالمائة. بدا أن بيرفينيوم باموات أقوى بواسطة القارئ لكنه لم يمكن تقييمه بالمجهر بسبب تألقه الخاص.

ضد B. henselae النامية كان MIC للميثيلين الأزرق 0.08 إلى 0.16 ميكروغرام لكل مل. وضد الخلايا الساكنة بعمر خمسة أيام بتركيز 5 ميكروغرام لكل مل، انخفض عدد المستعمرات إلى لا توجد مستعمرات قابلة للكشف بعد يوم واحد من التعرض، بما يتوافق مع دابتومايسين وبيرفينيوم باموات عند التركيزات المختبرة. استخدم تشغيل منفصل للقتل الزمني 10 ميكروغرام لكل مل. هذه مستويات تعرض مخبرية وليست جرعات، وتذكرها الورقة بهذه الصفة. تظهر قيمة بلازما بشرية قصوى قريبة من 3.9 ميكروغرام لكل مل في الورقة فقط كسياق خلفي. يوضح استعراض الحرائك الدوائية للميثيلين الأزرق سبب عدم إمكانية قراءة رقم البلازما على أنه رقم نسيجي.

هناك حدّان مذكوران بوضوح في الورقة. لم يكن هناك نموذج للأغشية الحيوية ولم تُختبر تركيبات الميثيلين الأزرق. كانت التجمعات بعمر خمسة أيام عبارة عن عناقيد في مزرعة سائلة ساكنة، وليست تجربة أغشية حيوية مثبتة. دعا المؤلفون إلى إجراء أبحاث على الحيوانات، وأبحاث التركيبات، وأبحاث الأغشية الحيوية، واختبارات على أنواع أخرى من بارتونيلا.

الخلايا المشتقة من التركيبات والأغشية الحيوية: Zheng وزملاؤه، 2020

أبقت المتابعة لعام 2020 في BMC Microbiology على السلالة والوسط نفسيهما، لكنها انتقلت إلى مزارع ساكنة بعمر ستة أيام وأضافت عنصرين افتقدتهما الورقة الأولى: التركيبات ثنائية الدواء ونموذج خلايا مشتقة من الأغشية الحيوية.

بالنسبة للأدوية المفردة بتركيز موحد 5 ميكروغرام لكل مل لمدة 24 ساعة، ترك الميثيلين الأزرق 3.2 مرات 10 إلى القوة 4 من وحدات تكوين المستعمرات لكل مل مقابل شاهد قريب من 2.8 مرات 10 إلى القوة 10. ترك سيبروفلوكساسين وجنتاميسين ونيتروفورانتوين مستعمرات أقل عند النقطة الزمنية نفسها. يختلف ذلك عن نتيجة 2019، حيث أعطى المستوى الاسمي نفسه عدم وجود مستعمرات قابلة للكشف بعد يوم واحد. اختلف عمر الزرع والكثافة والتعامل مع العينات، لذلك كان القتل متكررًا من حيث الاتجاه لكنه لم يكن مطابقًا من حيث المقدار. هذا التغير بين التشغيلات هو أحد أسباب اعتبار فحوصات السلامة والتداخلات القياسية قوة النشاط المخبري منفصلة عن التأثير السريري.

يُعد فحص التركيبات الجزء الأكثر اقتباسًا. تم تثبيت كل مكوّن عند 5 ميكروغرام لكل مل. أعطى كل من أزيثروميسين زائد ميثيلين أزرق وريفامبين زائد ميثيلين أزرق عدم وجود مستعمرات طور ساكن قابلة للكشف بعد 24 ساعة، وكذلك كلا تركيبي سيبروفلوكساسين، وكانت هذه التركيبات الأربعة فقط من بين 25 تركيبة مختبرة. لم يُجرَ تحليل تآزر رسمي، لذلك المصطلح الصحيح هو تركيبة نشطة تحت هذه الظروف، وليس تآزرًا مثبتًا.

اختبرت تجربة الأغشية الحيوية خلايا مسترجعة من غشاء حيوي مفكك حديثًا، وليس اختراق غشاء حيوي ناضج سليم. نُمّيت المزارع خمسة أيام، وخُففت في أطباق الآبار لمدة خمسة أيام إضافية، وتم تأكيدها بصبغة الكريستال البنفسجي، ثم كُشطت قبل التعرض للدواء. عند 5 ميكروغرام لكل مل، انخفض الميثيلين الأزرق وحده إلى 2.3 مرات 10 إلى القوة 2 بحلول اليوم 6، وكان من بين أفضل العوامل المفردة، لكنه لم يصل إلى الصفر. وصلت تركيبتا الميثيلين الأزرق إلى الصفر بحلول اليوم 6، وكذلك تركيبتا سيبروفلوكساسين.

أشار المؤلفون إلى الحدود نفسها التي قد يلاحظها القارئ الدقيق: غشاء حيوي صغير مكشوط بدلًا من غشاء حيوي قديم سليم، تركيز واحد مناسب لكل الأدوية بدلًا من تركيز واقعي خاص بكل دواء، أزواج مختارة فقط تتمحور حول أزيثروميسين أو ريفامبين، سلالة واحدة، لا حيوانات، ولا مرضى. تم اقتراح أبحاث لاحقة بثلاثة أدوية، لكنها لم تُنشر.

مقارنة تصميم الدراسات

الجدول هو جوهر هذا المقال في صورة مختصرة. كل ما يقع إلى يسار العمود الأخير هو عمل زرعي. لا تشغل أي من الورقتين العمود الأخير.

بارتونيلا ليست بوريليا

تذكر كلتا الورقتين بوريليا بورغدورفيري، وهي اللولبية المسببة لمرض لايم، لأن اختبار الصبغة جاء من أبحاث سابقة على بوريليا في الطور الساكن من المختبر نفسه، حيث سجل الميثيلين الأزرق ودابتومايسين أيضًا نتائج إيجابية. هذا التاريخ مفيد كسياق وهو مصدر شائع للخطأ.

لا تختبر أي تجربة في ورقتي بارتونيلا بوريليا جنبًا إلى جنب مع بارتونيلا. تختلف الكائنات، وتختلف الأوساط، وتختلف التركيزات، كما أن التأثير المفترض للميثيلين الأزرق على الغشاء في بارتونيلا ذُكر باعتباره فرضية تحتاج إلى مزيد من الدراسة. لا ينبغي نقل النتائج بين الأنواع، ولا تدعم أي من الورقتين ادعاءات عامة حول الطفيليات. تحافظ مقارنة حالات بوريليا وبارتونيلا الكامنة على الفصل بين الأدبيات لهذا السبب.

لماذا لا تتحول المزارع إلى بروتوكول

إن الاهتمام بالبحث عن بروتوكول ميثيلين أزرق لبارتونيلا مفهوم. هذه الأوراق هي السبب الذي يجعل التعامل مع هذا المصطلح كإشارة تحذير بدلًا من قائمة مشتريات أمرًا مناسبًا.

أولًا، 5 ميكروغرام لكل مل في بئر ليس وصفة علاجية. لا يرتبط به امتصاص أو توزيع أو ارتباط بالبروتين أو اختراق داخل الخلايا أو قدرة على التحمل. اختار المؤلفون هذا التركيز باعتباره متوسطًا تقريبيًا للقمم الدوائية وقالوا إن العمل المستقبلي يجب أن يستخدم كل دواء عند مستواه الواقعي الخاص به.

ثانيًا، يعني عدم وجود مستعمرات عدم وجود مستعمرات تحت ظروف الطلاء تلك، وليس تعقيم الأنسجة. تبقى الخلايا الكامنة والبكتيريا داخل الخلايا وحدود أخذ العينات خارج طبق الآغار.

ثالثًا، يمكن للتركيبات التي تعقم بئرًا أن تفشل أو تسبب ضررًا داخل الجسم. أزيثروميسين زائد ميثيلين أزرق وريفامبين زائد ميثيلين أزرق هما تركيبتان مخبريتان عند مستويات تعرض مخبرية. من دون حرائك دوائية على الحيوانات وبيانات بشرية مضبوطة لا توجد جرعة ولا مدة ولا نسبة فائدة إلى مخاطر. يجب على أي شخص يوازن بين الخيارات مناقشتها مع مختص رعاية صحية ومراجعة متى يحتاج استخدام الميثيلين الأزرق إلى إشراف طبي قبل استخلاص أي استنتاج من بيانات الأطباق المخبرية.

الاستنتاج المحدود الذي تدعمه هذه الأوراق هو التالي: يمتلك الميثيلين الأزرق نشاطًا متكررًا ضد B. henselae JK53 غير النامية في المختبر، بما في ذلك التركيبات المخبرية ثنائية الدواء، مع أقوى نتائج التركيبات ونتائج الخلايا المشتقة من الأغشية الحيوية القادمة من دراسة 2020. أما كل ما عدا ذلك، بما في ذلك ما إذا كان هذا النشاط مهمًا لداء البارتونيلا البشري، فما زال غير مختبر.