هل يعني ارتفاع استهلاك الأكسجين إنتاج مزيد من ATP؟ دروس من دراسات أزرق الميثيلين

توجد ميتوكوندريا معزولة في حجرة تحتوي على الوقود ولكن من دون ADP. وهي تستهلك الأكسجين ببطء. أضف ADP فيقفز استهلاك الأكسجين عدة أضعاف. انتظر حتى ينفد ADP فينخفض استهلاك الأكسجين مجددًا. لم يتغير الوقود قط. الذي تغير فقط هو الطلب على ATP.

يحتوي هذا التسلسل الصغير على كامل التمييز الذي تتناوله هذه المقالة. يقيس استهلاك الأكسجين مدى سرعة تدفق الإلكترونات عبر سلسلة التنفس إلى الأكسجين. أما إنتاج ATP فيقيس مقدار هذا التدفق الذي يُلتقط في صورة طاقة قابلة للاستخدام. ويشترك الاثنان في خطوة وسطى، هي تدرج البروتونات عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا، وأي عامل يغير مدى إحكام اقتران هذا التدرج بتخليق ATP يمكنه أن يدفع النتيجتين في اتجاهين مختلفين. ويُعد أزرق الميثيلين مثالًا تعليميًا مفيدًا هنا لأنه لوحظ وهو يفعل الأمرين معًا: يزيد استخدام الأكسجين بالتوازي مع ATP في بعض التحضيرات، ويزيد استخدام الأكسجين بينما يظل ATP ثابتًا أو ينخفض في تحضيرات أخرى.

يمكن للقراء الذين يريدون أولًا الصورة الأشمل لعملية نقل الإلكترونات أن يبدأوا بكيفية نقل أزرق الميثيلين للإلكترونات عبر سلسلة التنفس، ويمكن لمن يريدون فهم مصطلحات تجارب الأكسجين المبكرة أن يقرأوا ما أظهرته قياسات التنفس الأولى فعليًا.

التنفس وATP والتدرج الذي يفصل بينهما

تدخل الإلكترونات القادمة من NADH وFADH2 إلى السلسلة عند المركبين I وII، ثم تمر عبر المركب III إلى السيتوكروم c، وبعد ذلك عبر المركب IV إلى الأكسجين. وتُستخدم الطاقة المتحررة عند المركبات I وIII وIV لضخ البروتونات من المصفوفة إلى الحيز بين الغشائي. ويُعرف هذا الفصل في الشحنة والحموضة بالقوة الدافعة للبروتونات، وعادة ما يكون مكوّنها الكهربائي، أي جهد الغشاء، هو الجزء الغالب.

يسمح إنزيم تخليق ATP للبروتونات بالتدفق عائدة إلى المصفوفة ويستخدم الطاقة المتحررة لضم ADP والفوسفات لتكوين ATP. إذن، تكون السلسلة:

استهلاك الأكسجين، ثم ضخ البروتونات، ثم التدرج، ثم تخليق ATP.

لكن المشكلة أن البروتونات تستطيع العودة عبر مسارات أخرى. وكل عودة تتجاوز إنزيم تخليق ATP تُعد تسربًا للبروتونات. ويجبر التسرب السلسلة على ضخ البروتونات نفسها مجددًا للحفاظ على ثبات جهد الغشاء، ما يستهلك مزيدًا من الأكسجين من دون إنتاج مزيد من ATP. أما التسرب القوي بما يكفي فهو فك اقتران: يرتفع استخدام الأكسجين بينما يظل ATP ثابتًا أو ينخفض، وتخرج الطاقة المهدرة في صورة حرارة.

الحالة 3 والحالة 4 ونسبة التحكم التنفسي

تأتي المصطلحات الكلاسيكية لهذه الظاهرة من دراسات الميتوكوندريا المعزولة. الحالة 3 هي التنفس في وجود الركيزة مع ADP: يستنزف إنزيم تخليق ATP التدرج، وينخفض جهد الغشاء، فتتسارع السلسلة لإعادة بنائه، ويكون استخدام الأكسجين مرتفعًا لأن ATP يُنتج. أما الحالة 4 فهي التنفس بعد نفاد ADP: يصبح إنزيم تخليق ATP شبه خامل، ويرتفع التدرج، ويقاوم جهد الغشاء المرتفع المزيد من الضخ، وينخفض استخدام الأكسجين إلى المستوى اللازم لتعويض التسرب.

لذلك فإن نسبة التحكم التنفسي، أي الحالة 3 مقسومة على الحالة 4، تشير إلى مدى إحكام اقتران التحضير. وتعني النسبة المرتفعة أن ADP يتحكم في التنفس بقوة. أما انخفاض النسبة مع ارتفاع الحالة 4 فيعني أن التسرب بدأ يهيمن. ومن خلال هذه العدسة تصبح نتائج أزرق الميثيلين أدناه مفهومة.

هناك نموذج ذهني يستحق الاحتفاظ به. جهد الغشاء المرتفع يبطئ السلسلة. وتبديد الجهد يسرّعها. تستجيب السلسلة لمدى صعوبة عملية الضخ، لا مباشرةً لما إذا كان ATP يُنتج أم لا.

عندما تتحرك النهايتان معًا

يأتي أوضح مثال على الاقتران من ميتوكوندريا دماغ خنزير غينيا المعزولة مع تثبيط المركبات التنفسية. عند 100 nanomolar إلى 1 micromolar من أزرق الميثيلين، ارتفع استهلاك الأكسجين في حالة الراحة عند استخدام الغلوتامات مع المالات، أو السكسينات، أو الغليسيروفوسفات وقودًا، بينما لم يتغير التنفس المحفز بـ ADP. وفي الميتوكوندريا التي عُطّل فيها المركب I أو المركب III، زادت الصبغة إنتاج ATP بدرجة متواضعة، واستعادت جهد الغشاء، وحسّنت امتصاص الكالسيوم. والمسار المقترح هو اختصار: تقبل الصبغة الإلكترونات قبل موضع التعطيل وتنقلها إلى السيتوكروم c، متجاوزة المركب المتضرر.

وتستخدم حالة اقتران ثانية مصدرًا مختلفًا تمامًا لـ ATP. ففي ميتوكوندريا دماغ معزولة مع تثبيط إنزيم تخليق ATP، ظل أزرق الميثيلين يحفز التنفس على كل ركيزة جرى اختبارها. لكن تخليق ATP ارتفع فقط مع alpha ketoglutarate والغلوتامات، وهما الركيزتان اللتان تكوّنان succinyl CoA. ومع قيام oligomycin بتثبيط إنزيم تخليق ATP، جاء ATP الإضافي من الفسفرة على مستوى الركيزة بواسطة succinyl CoA ligase في دورة حمض الستريك، لا من الفسفرة التأكسدية. كما استعادت الصبغة جهد الغشاء عندما جرى تثبيط المركب I وإنزيم تخليق ATP معًا. هنا تحرك استخدام الأكسجين وATP معًا، ولكن فقط عندما سمحت الركيزة بمسار ATP الثاني. أما مع السكسينات أو المالات، فقد ارتفع التنفس من دون ATP إضافي. الصبغة نفسها، والحجرة نفسها، ووقود مختلف، وإجابة مختلفة.

عندما تتباعد النهايتان

حالات التباعد منشورة بالقدر نفسه ومفيدة بالقدر نفسه. ففي دراسة على ميتوكوندريا كبد الجرذان المعزولة من 1997، سرّع أزرق الميثيلين تنفس الحالة 4 في ميتوكوندريا تتنفس بالسكسينات ومقترنة بإحكام، ما أدى إلى خفض نسبة التحكم التنفسي. ظهر التأثير بدءًا من 0.5 micromolar وكان قويًا عند 5 micromolar، وهو تركيز قريب من مستويات البلازما بعد دفعة وريدية مقدارها 100 milligram. وعند 5 micromolar انتفخت الميتوكوندريا أيضًا، مع أن خلل الاقتران ظهر أولًا عند تركيزات أقل، ما يرجح أن التسرب سبق الضرر البنيوي بدلًا من أن يكون ناتجًا عنه. وفي الميتوكوندريا مفكوكة الاقتران، حفزت الصبغة التنفس بطريقة قابلة للتشبع وتعتمد على التركيز. ارتفع استخدام الأكسجين في كلا التحضيرين. أما تخليق ATP لكل مقدار من الأكسجين المستهلك فلم يرتفع. وهذا مثال نموذجي على فك الاقتران إلى جانب نقل الإلكترونات، في الجزيء نفسه.

ويأتي أوضح انفصال من الشبكية. ففي الفئران المفتقرة إلى AIF والخلايا المستقبلة للضوء المعالجة بالروتينون، حافظ أزرق الميثيلين على سُمك الشبكية، وواسمات المستقبلات الضوئية، وبنية الميتوكوندريا، كما خفّض نسبة NADH إلى NAD وهدّأ مسارات الإجهاد، بما فيها استجابة البروتين غير المطوي والالتهام الذاتي للميتوكوندريا. وقد فعل ذلك من دون تصحيح النقص في ATP. إن الحفاظ على النسيج من دون استعادة الطاقة يعني أن الأثر مر عبر توازن الأكسدة والاختزال وسلامة الميتوكوندريا، لا عبر ATP إضافي. وأي شخص يساوي بين بقاء النسيج واستعادة إنتاج الطاقة سيقرأ تلك التجربة قراءة خاطئة تمامًا.

وتضيف أبحاث ميتوكوندريا الدماغ خانة للتكلفة في السجل نفسه. فالتركيزات المنخفضة نفسها التي حسّنت المؤشرات الحيوية للطاقة زادت أيضًا توليد بيروكسيد الهيدروجين في جميع الظروف المختبرة وأبطأت التخلص منه، وقد قيس ذلك باستخدام اختبار Amplex مُعاير بدلًا من صبغة غير نوعية. جاء المزيد من ATP والمزيد من المؤكسدات معًا.

قائمة تحقق عملية للقراءة

هناك أربعة أسئلة تميز النتيجة المقترنة عن غير المقترنة.

أولًا، ما النتيجة التي جرى قياسها فعليًا. لا يستطيع استهلاك الأكسجين وحده الإبلاغ عن ATP. ويضيف كل من تخليق ATP، وجهد الغشاء، ونسبة التحكم التنفسي جزءًا لا يستطيع قطب الأكسجين رؤيته. ويشرح دليل قراءة الادعاءات البحثية المتعلقة بأزرق الميثيلين هذا الانضباط في اختيار نقاط القياس بالتفصيل.

ثانيًا، ما الركيزة التي غذّت الميتوكوندريا. تُظهر نتيجة succinyl CoA أن اختيار الوقود يمكنه تحديد ما إذا كان التنفس الإضافي قادرًا أصلًا على التحول إلى ATP إضافي.

ثالثًا، ما التركيز المستخدم. أعطى أزرق الميثيلين بتركيزات من nanomolar إلى micromolar منخفض في ميتوكوندريا الدماغ مكاسب متواضعة في المؤشرات الحيوية للطاقة مع تكلفة مؤكسدة؛ وأدت تركيزات 0.5 micromolar فما فوق في ميتوكوندريا الكبد إلى إضعاف الاقتران؛ وأضاف 5 micromolar الانتفاخ. التركيز جزء من الآلية، لا تفصيلًا هامشيًا.

رابعًا، ما النموذج الذي أُجريت عليه النتيجة. تكشف الميتوكوندريا المعزولة التوصيلات الأساسية، لكن الخلايا والأنسجة السليمة تضيف النقل، والاختزال إلى الشكل عديم اللون، ومسارات متنافسة لاستهلاك الإلكترونات. وتشكل دراسات الجرعات المخبرية، بما في ذلك كيفية تشكيل التركيز والبروتوكول لتأثيرات أزرق الميثيلين، الجسر بين أرقام الحجرة وأي ادعاء يتعلق بشخص.

يعبّر استهلاك الأكسجين عن تدفق الإلكترونات. ويعبّر ATP عن مقدار هذا التدفق الذي جرى التقاطه. ويمكن لأزرق الميثيلين أن يغير أيًا منهما، وتوضح التجارب أعلاه جميع التركيبات الأربع الناتجة: يرتفع الاثنان، أو يرتفع التنفس فقط عندما تسمح الركيزة بذلك، أو يرتفع التنفس بينما ينخفض الاقتران، أو يُحافَظ على النسيج بينما يظل ATP ثابتًا. الرقم الظاهر على قطب الأكسجين هو بداية التفسير، لا نهايته. :::