التجارب التي ربطت أزرق الميثيلين بالتنفس الخلوي

الدم البشري منزوع الفيبرين، الذي دُفئ إلى 37 °C لمدة ثلاث ساعات، يستهلك نحو اثنين في المئة من الأكسجين الذي يحتويه. أضف كمية صغيرة من أزرق الميثيلين قبل الحضانة، وسيستهلك الدم نفسه نحو خمسة وستين في المئة. لم يتغير شيء في الخلايا. الذي تغير فقط هو المحلول.

يأتي هذا الرقم من بحث نُشر عام 1928 بواسطة George Harrop و E. S. Guzman Barron في Johns Hopkins، وهو مصدر العبارة المتكررة على نطاق واسع بأن أزرق الميثيلين يحسن التنفس الخلوي. العبارة ليست خاطئة، لكنها أضيق مما تبدو عليه.

ما الذي يقيسه الرقم في الجدول فعليًا

كانت نقطة القياس النهائية هي امتصاص الأكسجين، والتي حُددت بواسطة تحليل الغاز. قام Harrop وBarron بترشيح الدم المسحوب حديثًا عبر الصوف القطني عند 10 °C لإزالة خلايا الدم البيضاء، ثم أشبعوا العينة بالأكسجين، وقسموها، وأضافوا الصبغة إلى جزء واحد، وحللوا الجزأين بعد الحضانة. نادرًا ما تجاوزت أعداد الكريات البيضاء نحو ألف خلية لكل مليمتر مكعب. أُبلغ عن استهلاك الأكسجين باعتباره نسبة من محتوى الأكسجين الأولي للعينة الذي اختفى.

كما قاسوا ثاني أكسيد الكربون، وهناك قاومت الطريقة ذلك. أطلق الدم منزوع الفيبرين ما يصل إلى اثنين مليمول من ثاني أكسيد الكربون لكل 100 mL خلال الساعة الأولى من الحضانة لأسباب غير مرتبطة بالتفاعل قيد الدراسة، لذلك كانت معاملات التنفس للدم الكامل غير قابلة للاستخدام. فقط الخلايا المغسولة في محلول Locke أعطت أرقامًا قابلة للتفسير، وكانت هذه بين 0.73 و0.80 مع الصبغة وبدونها.

هذه التفاصيل ليست أمرًا ثانويًا. "التنفس" في هذه الأبحاث يعني تبادل الغاز عبر وعاء مغلق. الفجوة بين استهلاك الأكسجين وإنتاج الطاقة المفيدة تُبحث بشكل منفصل في ما يخبرك به استهلاك الأكسجين عن ATP وما لا يخبرك به.

أضافت الصبغة أكبر تأثير حيث كان تنفس الخلايا أقل

لا تملك كريات الدم الحمراء الناضجة لدى الثدييات استهلاكًا ملحوظًا للأكسجين تقريبًا. أما كريات الدم الحمراء لدى الطيور ذات النوى فتستهلك الأكسجين. أجرى Harrop وBarron التجارب على النوعين، وكان هذا التباين أساس حجتهما.

في عينات الثدييات أنتجت الصبغة زيادات بمقدار عشرين إلى خمسين ضعفًا. أما في دم الإوز، حيث كانت الخلايا تتنفس أصلًا، فلم تضاعف المعدل أكثر من ذلك. كلما كان معدل التنفس الابتدائي أعلى، قل ما يمكن للصبغة إضافته.

ويظهر التدرج نفسه داخل النوع الواحد. عينة بشرية من مريض مصاب بكثرة الحمر الحقيقية، وتحتوي على خلايا غير ناضجة، استهلكت 11.3 في المئة من أكسجينها دون وجود الصبغة، مقابل 2.8 في المئة للخلايا المغسولة من متبرع سليم. رفعت الصبغة ذلك فقط إلى 63.4 في المئة، أي تسارعًا بمقدار ستة أضعاف، بينما تسارعت الخلايا الطبيعية بما يقارب ثلاثين ضعفًا. دفعت الصبغة الخلايا الناضجة نحو سلوك الخلايا غير الناضجة، وهذا هو ما قال المؤلفون إنها تفعله.

كان ينبغي أن يوقفه السيانيد

كان معروفًا أن السيانيد يوقف أكسدة الخلايا. أضاف Harrop وBarron السيانيد رغم ذلك، إلى جانب الصبغة.

نتائج دم البقر تمثل ذلك. انخفض محتوى الأكسجين من 22.61 إلى 22.03 حجمًا مئويًا خلال ثلاث ساعات دون إضافات. مع أزرق الميثيلين انخفض إلى 12.84. ومع أزرق الميثيلين وواحد من خمسة آلاف من مولار سيانيد البوتاسيوم، انخفض إلى 12.74. ظل تأثير الصبغة دون تغيير تقريبًا.

الشكل: سجل تنفس دقيق مستمر لكريات الدم الحمراء البشرية. يشير السهم إلى إضافة أزرق الميثيلين. قبل ذلك كان المنحنى شبه مسطح؛ وبعده يرتفع بثبات. أعيد الإنتاج من Harrop and Barron، Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928)، PMID 19869478.

كان استنتاجهما أن الصبغة تعمل كحامل للأكسجين، "بتوفير مادة اختفت من كريات الدم الحمراء البالغة غير ذات النوى لدى الثدييات". بعد عامين، وضع Michaelis وSalomon في Rockefeller Institute الخلاف بصيغته الدائمة. إما أن تأثير الصبغة كان "خاصية عرضية للصبغة"، أو أن الصبغة كانت "نموذجًا لمادة مجهولة في الكائنات الحية". لم يُغلق هذا الفرع. لكن ما تغير هو أن الخلايا يمكن وصفها الآن بدقة أكبر بكثير.

مستخلص الكبد فعل الشيء نفسه

أظهر Michaelis وSalomon أن المستخلصات المائية الباردة للأعضاء تنتج التحفيز نفسه. كان كبد الجرذان الأقوى، يليه الكلى والطحال والخصية. أما الدماغ والعضلات ومصل الدم فكان تأثيرها قليلًا أو معدومًا.

ثم اختبروا المستخلص مقابل أول أكسيد الكربون. لم يتغير التنفس المحفز بواسطة المستخلص أو الصبغة في مزيج من 98 في المئة أول أكسيد الكربون و2 في المئة أكسجين. أما المزيج الغازي نفسه فقد ثبط تنفس الخميرة وتنفس كريات الدم الحمراء للدجاج ذات النوى بنحو 60 إلى 80 في المئة، بما يتوافق مع وصف Warburg لإنزيم تنفس حساس لأول أكسيد الكربون. لذلك لم تكن مادة النسيج المجهولة هي إنزيم Warburg.

سقطت عدة هويات محتملة في الطريق. أنتج الغلوتاثيون المختزل والسيستئين فقط استهلاك الأكسجين المطلوب لأكسدتهما الذاتية. تم استبعاد مرافق الإنزيم الخاص بـ Harden وYoung لأن العضلات تحتوي على أكبر كمية منه وأظهرت تقريبًا أقل تأثير. وواجه سيتوكروم Keilin، الذي سُمي قبل بضع سنوات، التناقض نفسه. أما اقتراحهما الخاص بأن المادة الفعالة جاءت من نواة الخلية فقد وصفاه بأنه مجرد اقتراح.

كان للتأثير شروط مرتبطة به

كان يجب أن تبقى الخلايا سليمة. أدى تحلل الدم بالماء المقطر أو التجميد المتكرر إلى إلغاء الاستجابة لكل من الصبغة والمستخلص، كما خفض التحلل الجزئي التأثير بما يتناسب معه.

كان السكر مطلوبًا أيضًا. دعمت الغلوكوز والفركتوز والسكروز التنفس الناجم عن الصبغة؛ أما المانيتول فلم يفعل ذلك. في غياب السكر لم يحدث تنفس إطلاقًا، وبدا أن الصبغة ألحقت ضررًا بالخلايا أثناء العملية، لذلك لم يُعد الغلوكوز المضاف بعد ساعة أو ساعتين التأثير. اقترح المؤلفون أن الصبغة كانت تؤكسد مكونًا بنيويًا تحتاجه الخلية.

زادت الإضاءة تأثير الصبغة بدرجة كبيرة، رغم أن التأثير كان واضحًا في الظلام. تصرفت أصباغ أخرى قابلة للاختزال بشكل مختلف: طابقت الصبغة الزرقاء التولويلية أزرق الميثيلين أو تجاوزته، بينما لم يفعل إنديجو ثنائي السلفونات شيئًا تقريبًا. لم تظهر علاقة واضحة بين جهد الأكسدة والاختزال للصبغة وحجم تأثيرها، وعزا المؤلفون ذلك إلى نفاذية الغشاء والسمية.

ارتبط التأثير بالتخمر وليس بالتنفس

انتقلت دراسة Barron عام 1930 من معلقات الخلايا إلى شرائح أنسجة من أعضاء جرذان طبيعية وأورام مزروعة.

في الأنسجة التي لا تحتوي على تحلل سكري هوائي، لم يفعل أزرق الميثيلين شيئًا أو خفض استهلاك الأكسجين قليلًا: الكلى بنحو 14 في المئة، والبنكرياس بنحو 14 في المئة، والكبد بنحو 5 في المئة. في الأنسجة التي تخمر بوجود الأكسجين، زاد الاستهلاك: الطحال بنحو 8 في المئة، والدماغ بنحو 13 في المئة. تراوحت زيادات الأورام من نحو 27 في المئة في سرطان ثدي بشري إلى أكثر من 80 في المئة في ساركوما Rous للدجاج، بما يتناسب تقريبًا مع التحلل السكري الهوائي لكل نسيج.

الشكل: كل نقطة تمثل نوعًا واحدًا من الأنسجة. المحور الأفقي هو التحلل السكري الهوائي؛ والمحور العمودي هو التغير في استهلاك الأكسجين بعد أزرق الميثيلين. بيانات من Barron، Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930)، الجدول 6، PMID 19869777.

أنتجت تجربة السيانيد بعد ذلك الصورة المعاكسة. عندما حُجب التنفس في تلك الأنسجة غير المستجيبة سابقًا بالسيانيد وظهر التخمر، زادت الصبغة استهلاك الأكسجين مرة أخرى: الكلى بنحو 59 في المئة، والكبد بنحو 19 في المئة، والطحال بنحو 286 في المئة، والخصية بنحو 200 في المئة.

اقترح Barron أن الصبغة يمكن أن تكون اختبارًا للقوة التخمرية لخلية أو نسيج، واختتم بتكهن: قد تجعل أجيال من زراعة الأورام في وسط يحتوي على الصبغة استقلاب الورم يومًا ما مشابهًا دائمًا لاستقلاب النسيج الطبيعي. كان ذلك سؤالًا بحثيًا مكتوبًا عام 1930. وليس ادعاءً علاجيًا.

ما الذي لم يكن من الممكن أن تقيسه التجارب

في عامي 1928 و1930، كان "التنفس" يعني استهلاك الأكسجين. أُبلغ عن الأدينوزين ثلاثي الفوسفات لأول مرة عام 1929، وجاء إثبات أن الميتوكوندريا المعزولة تستر الفوسفات أثناء نقل الإلكترونات عام 1949. لم تستطع أي من أبحاث أزرق الميثيلين المبكرة قياس إنتاج الطاقة، ولم تدّعِ ذلك.

الخلايا هي المشكلة الثانية. لا تحتوي كريات الدم الحمراء الناضجة لدى الثدييات على ميتوكوندريا. خلال مرحلة الخلايا الشبكية تتخلص من الميتوكوندريا والريبوسومات عبر الالتهام الذاتي الانتقائي، ولهذا تعمل الخلية الحمراء الناضجة على التحلل السكري وتعتمد على مسار فوسفات البنتوز أساسًا لإنتاج NADPH وليس ATP. في تجارب عام 1928 لم تكن هناك سلسلة نقل إلكترون موجودة لإصلاحها. أي شيء استهلك الأكسجين كان يفعل شيئًا آخر.

ما كان ذلك الشيء الآخر أصبح موصوفًا الآن بدرجة معقولة. يستقبل أزرق الميثيلين الإلكترونات من المكافئات الاختزالية الخلوية ويتحول إلى ليوكوأزرق الميثيلين، ثم يعاد تأكسده بواسطة الأكسجين الجزيئي، مما يغلق الدورة. في خلايا الدم الحمراء البشرية، تؤدي إنزيمات الاختزال المعتمدة على NADPH والفلافين وإنزيمات اختزال ثنائي الكبريتيد المرتبطة بها خطوة الاختزال. وجدت دراسة عام 1976 باستخدام الغلوكوز الموسوم أن الصبغة تحفز مسار أحادي فوسفات الهكسوز، وأن التأثير عند التركيز المنخفض يعتمد على أوكسي هيموغلوبين، وأن تركيزًا أعلى، 0.1 mM، يولد بيروكسيد الهيدروجين. الصبغة المختزلة عند مقابلتها للأكسجين تنتج بيروكسيدًا، وليس روابط فوسفاتية.

في الميتوكوندريا الصورة أكثر خلافية مما تعترف به الملخصات الشائعة. يرى أحد خطوط البحث أن الصبغة تأخذ الإلكترونات من منطقة المعقد I وتسلمها إلى السيتوكروم c. ووجد بحث آخر أنها في ميتوكوندريا دماغ الفأر لا تستطيع استعادة التنفس بعد تثبيط الأنتيميسين، ووضع مستقبل الإلكترونات عند موقع ارتباط اليوبيكوينول في المعقد III بدلًا من ذلك. ووجد بحث ثالث أن التراكيز المنخفضة رفعت استهلاك الأكسجين في حالة الراحة مع بقاء التنفس المحفز بـ ADP دون تغيير. العبارة الأكثر مباشرة للنقطة هي أن استهلاك الأكسجين الناجم عن أزرق الميثيلين لا يعتمد على الفسفرة التأكسدية على الإطلاق: فقد استمر عندما ثُبطت سلسلة التنفس، وفي تحضيرات لا تحتوي عليها.

توجد قياسات مباشرة للفجوة بين الكميتين أيضًا. في ميتوكوندريا كبد الجرذان المعزولة، خفضت زيادة تراكيز الصبغة نسب التحكم التنفسي وتسببت في الانتفاخ، وهو ما وصفه المؤلفون بأنه فصل الفسفرة التأكسدية. وفي كبد الجرذان المروى، رفع أزرق الميثيلين استهلاك الأكسجين بينما انخفضت نسبة ATP إلى ADP.

يحمل السجل السريري الرسالة نفسها. يُعالج تسمم الميتهيموغلوبين بـ نحو واحد إلى اثنين مليغرام من أزرق الميثيلين لكل كيلوغرام عن طريق الوريد، عبر مسار اختزال يعتمد على NADPH، وتسبب الجرعات الأكبر الحالة التي يجري علاجها. يذكر الاستعراض نفسه أن التأثير المضاد للتسمم يكون أكبر في كريات الدم الحمراء السليمة ويقل عند وجود انحلال الدم، وهو اكتشاف انحلال الدم لعام 1930 يعاود الظهور بعد ثلاثة وسبعين عامًا في سياق المستشفى. المركب الذي تقع تأثيراته المفيدة والضارة على جانبي عتبة جرعة لا يمكن استنتاج جرعته من قياس استهلاك الأكسجين.

لماذا تنتمي الدفعة إلى النقاش

لاحظ Harrop وBarron شيئًا يستحق قراءة ثانية. ينتج أزرق الميثيلين نفسه شريطًا في المطياف بين الشريطين المميزين للميتهيموغلوبين، "مما قد يسبب بسهولة التباسًا عند الفحص السريع". يمكن للصبغة أن تحاكي المادة التي يجري البحث عنها.

للمشكلة نفسها شكل كيميائي. تحمل مادة فينوثيازينية مرتبطة موجودة كمكوّن ثانوي سلوك أكسدة واختزال خاصًا بها، ونفاذية خاصة بها، وسمية خاصة بها. توضح حالة موثقة واحدة أهمية ذلك: في دراسة عن يودنة أزرق الميثيلين، أنتجت العينات التي تحتوي على نحو 7 إلى 8 في المئة من [Azure B](/en/articles/