በሜቲሊን ሰማያዊ የሚደረጉ የእርሾ ምርመራዎች፦ ሕያው ሕዋሳትን መቁጠር እና የትንፈሳ ጊዜን መለካት

በላቦራቶሪው ጠረጴዛ ላይ ሁለት ቱቦዎች ተቀምጠዋል። ሁለቱም ሰማያዊ ናቸው። በአንደኛው ውስጥ፣ በማይክሮስኮፕ የሚታዩ ሰማያዊ ሕዋሳት የሞተ እርሾን ያመለክታሉ። በሌላኛው ውስጥ ደግሞ፣ ከሰማያዊነት ወደ ቀለም አልባነት የሚቀየር ቱቦ እርሾው ሕያው እንደሆነና ትንፈሳ እያከናወነ እንደሆነ ያመለክታል። ቀለሙ አንድ ቢሆንም፣ የውጤቶቹ ትርጉም ተቃራኒ ነው። ሁለቱን ምርመራዎች ካምታቱ፣ ሁሉም መደምደሚያዎች ይገለበጣሉ።

ይህ ልዩነት የጽሑፉ ዋና ጉዳይ ነው። ሜቲሊን ሰማያዊ የኦክሲዴሽንና ሪዳክሽን ቀለም ነው፦ ኦክሲዴሽን ሲከሰትበት ሰማያዊ ይሆናል፤ ሪዳክሽን ሲከሰትበት ደግሞ ቀለም አልባ ሉኮሜቲሊን ሰማያዊ ይሆናል። የሕያውነት ቆጠራ ይህን ኬሚስትሪ በአጭር የማይክሮስኮፕ ምልከታ ይጠቀምበታል። የትንፈሳ ሙከራ ደግሞ ይህንኑ ኬሚስትሪ በጠቅላላው ድብልቅ ውስጥ በሚካሄድ፣ ጊዜው በሚለካ ምላሽ ይጠቀምበታል። እያንዳንዱ የራሱን የአሠራር ደንብ፣ የራሱን መቆጣጠሪያዎች እና የራሱን ጥንቃቄ የተሞላ ግምገማ ይፈልጋል።

የሕያውነት ቆጠራ፦ ለአጭር ጊዜ ቀለም ቀብቶ ወዲያውኑ ማንበብ

በቢራ ፋብሪካዎች የሚጠቀሙበት የአሠራር ደንብ ከሁሉ የበለጠ መስፈርት የተቀመጠለት ነው። በ2% ሶዲየም ሲትሬት ውስጥ 0.01% w/v ሜቲሊን ሰማያዊ ያዘጋጁ፣ ከእርሾ እገዳው ጋር በ1:1 ያቀላቅሉት፣ ከአጭርና ቋሚ የጊዜ ክፍተት በኋላም ድብልቁን ይመርምሩ። በታተሙ መመሪያዎች ውስጥ የጊዜ ክፍተቶቹ ይለያያሉ፤ በቢራ ጠመቃ ሳይንስ ኢንስቲትዩት መመሪያ ከ1 እስከ 2 ደቂቃዎች፣ በምርምር የአሠራር ደንቦች ደግሞ ወደ 5 ደቂቃዎች ናቸው፤ የOIV የወይን ጠጅ ማይክሮባዮሎጂ ዘዴ ግን ምርመራው በ10 ደቂቃዎች ውስጥ እንዲካሄድ ይጠይቃል። በቆጠራ ድብልቁ ውስጥ ያለው የቀለም ክምችት በመጨረሻ ወደ 0.005% ይጠጋል። የተሻሻለ የNeubauer ቆጠራ ክፍል ይሙሉ፤ በ400x አካባቢ ማጉላት ላይ ጥቁር ሰማያዊ ሕዋሳትን ሕያው እንዳልሆኑ፣ ቀለም ያልያዙ ሕዋሳትን ደግሞ ሕያው እንደሆኑ ይመድቡ። በOIV ዘዴ ፈዛዛ ሰማያዊ ሕዋሳት ሕያው ተብለው ይመዘገባሉ፤ ይህም ከታች የተብራራውን፣ ውጤቱ በመርማሪው የግል ግምት የመወሰን ችግር አስቀድሞ ያመለክታል።

የሕዋሳት ክምችት የሚሰላው ከቆጠራ ክፍሉ ጂኦሜትሪ ነው። ሙሉው ማዕከላዊ 1 mm ካሬ ሲቆጠር፣ በእያንዳንዱ mL ያሉ ሕዋሳት ብዛት N በማቅጠኛ ብዜትና በ10^4 ተባዝቶ ይገኛል፤ N በዚያ ቦታ ውስጥ የተቆጠሩት ሕዋሳት ብዛት ነው፣ ይህም በASBC የእርሾ ዘዴዎች ተገልጿል። ሕያውነትን መስላት ይበልጥ ቀላል ነው፦ ቀለም ያልያዙ ሕዋሳትን በጠቅላላ ሕዋሳት ብዛት አካፍሎ በ100 ማባዛት። ሕያውነትን ለመገመት፣ የFEMS የቢራ ፋብሪካ ንጽጽር ጥናትን እና የOIV አሠራርን በመከተል ወደ 400 ሕዋሳት ይቁጠሩ። አንድ የድንበር ደንብ በወጥነት ይጠቀሙ፤ ለምሳሌ፣ በታችኛውና በግራው የፍርግርግ መስመሮች ላይ ያሉ ሕዋሳትን በቆጠራው ውስጥ ያካትቱ፣ በላይኛውና በቀኙ ላይ ያሉትን ደግሞ ያስቀሩ።

ቆጠራ ከመጀመሩ በፊት ለቡቃያዎች ደንብ መወሰን ያስፈልጋል። የተለመደው አሠራር፣ ቡቃያው ከእናት ሕዋሱ መጠን ግማሽ ያህል ሲደርስ እንደ ለየ ሕዋስ መቁጠር፣ ከዚያ በታች ከሆነ ደግሞ ከእናት ሕዋሱ ጋር አንድ አድርጎ መቁጠር ነው። የትኛውም ደንብ ቢመረጥ፣ በሁሉም ካሬዎች ላይ ይተግብሩት፣ ቀጣዩ ሰውም እንዲደግመው በመመዝገቢያው ላይ ይጻፉት።

የቆጠራ መመዝገቢያ (ይህን ያትሙ)

ይህ መመዝገቢያ ለዚህ ጽሑፍ በተለይ የተዘጋጀ ነው። ወደ ማስታወሻ ደብተር ይቅዱት ወይም ለእያንዳንዱ ናሙና አንድ ያትሙ።

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, N ከተወሰነው የቆጠራ ክፍል ቦታ የሚገኝ ቆጠራ ነው። የቀለም መቀባት ጊዜ ክፍተቱን ከውጤቱ ጎን ይመዝግቡ፤ ምክንያቱም የጊዜ መረጃ የሌለውን የሕያውነት ቁጥር በድጋሚ ማግኘት አይቻልም።

የሕያውነት ውጤቶች ለምን ይለዋወጣሉ

ጊዜ የመጀመሪያው ውጤት አዛቢ ሁኔታ ነው፣ ተጽዕኖውም በሁለቱም አቅጣጫዎች ይሠራል። ንቁ ሜታቦሊዝም ያላቸው ሕዋሳት ቀለሙን ሪዳክሽን ያደርጉታል፤ ስለዚህ ቶሎ የሚደረግ ንባብ ሕያው ሕዋሳት ሪዳክሽኑን ከመጨረሳቸው በፊት ሊያሳያቸውና በስህተት እንደ ሞቱ ሊመድባቸው ይችላል። ሆኖም ለረጅም ጊዜ ለቀለሙ መጋለጥ በራሱ መርዛማ ነው፣ በእርግጥ የተጎዱ ሰማያዊ ሕዋሳትንም ይፈጥራል፤ ይህም ሞትን የሚያመለክት አሳሳች ቀለም መያዝ ያስከትላል። ስለዚህ አንድ የላቦራቶሪ ማስተማሪያ የአሠራር ደንብ፣ በዊስኮንሲን የእርሾ ማስተማሪያ መመሪያ እንደተመዘገበው፣ መመደቡ በ5 ደቂቃዎች ውስጥ እንዲካሄድ ይወስናል። ጥንቃቄ የተሞላው አቀራረብ፣ በሜቲሊን ሰማያዊ የሚደረግ ምደባ በጊዜ ላይ የሚመረኮዝ መሆኑን መቀበል ነው፤ ስለዚህ አንድ አጭር የጊዜ ክፍተት ይወስኑና በአንድ ተከታታይ ምርመራ ውስጥ ለሁሉም ናሙናዎች ቋሚ ያድርጉት።

ዝቅተኛ ሕያውነት ያላቸው ናሙናዎች ሁለተኛ አይነት የውጤት ዝንባሌ አላቸው። መስፈርት የተቀመጠለት ዘዴ፣ ሕያውነት ከ80% ገደማ በታች ሲሆን ሜቲሊን ሰማያዊ እውነተኛውን ሕያውነት ከመጠኑ በላይ ሊገምት እንደሚችል ያስጠነቅቃል፤ ምክንያቱም ቀለሙን አሁንም ሪዳክሽን ማድረግ የሚችሉ ሕዋሳት የመራባት ችሎታቸውን የጠበቁ መሆን አያስፈልጋቸውም። የቢራ ጠመቃ ጽሑፎችም ሕያውነት በከፍተኛ ደረጃ ሲቀንስ ተመሳሳይ አለመታመንን ይገልጻሉ። ሜቲሊን ሰማያዊን እንደ ፈጣን፣ ግምታዊ መለኪያ ይውሰዱት፤ ዝቅተኛ ሕያውነትን ተመልክተው የሚወሰኑ ወሳኝ ውሳኔዎችን፣ ለምሳሌ የእርሾ ባህልን ለአዲስ ጠመቃ እንደገና መጠቀምን፣ በማሳደጊያ ሳህን ቆጠራ ወይም በተጨማሪ ማቅለሚያ ያረጋግጡ።

ሦስተኛው የናሙናው ድብልቅ አካባቢ ተጽዕኖ ነው። የOIV ዘዴ በpH 4.6 አካባቢ ይሠራል፤ ጠንካራ የpH መቋቋም አቅም ያላቸው ዝቅተኛ pH ናሙናዎች ቀለሙ በትክክል እንዳይሠራ እንደሚያደርጉ ያስጠነቅቃል። በተጨማሪም፣ ከ100 g/L በላይ ስኳር ባለበት ሁኔታ ምርመራውን እንዳይጠቀሙ ይመክራል፣ ምክንያቱም ሕዋሳት አሳሳች ፈዛዛ ሰማያዊ ሆነው ይታያሉ። የማቅለሚያ pH የሙከራ ንጽጽር፣ በተፈተነው ክልል ውስጥ የመለየት ችሎታው በከፍተኛ ደረጃ እንደተለወጠ አግኝቷል፤ ይህም በpH ላይ የሚመረኮዝ የሜቲሊን ሰማያዊ ዘዴ ጥናት ከሚያሳየው ጋር ይስማማል። ፍርስራሾች የተለየ ወጥመድ ናቸው፦ በቆሻሻ የጠመቃ ድብልቆች ውስጥ ቀለም የያዙ ቅንጣቶች የሞቱ ሕዋሳትን ይመስላሉ፣ ከአንድ መርማሪ ወደ ሌላው የሚታየውንም የውጤት ልዩነት ያሳድጋሉ።

ይህ የውጤት ልዩነት በቁጥር የተለካ እንጂ በግል ታሪኮች ላይ የተመሠረተ አይደለም። በFEMS የእርሾ ንጽጽር በተዘገበ የስድስት ወር የቢራ ፋብሪካ ሙከራ፣ በድጋሚ የተደረጉ የሜቲሊን ሰማያዊ ልኬቶች በአማካይ 6.1% መደበኛ መዛባት ነበራቸው፤ በኦክሶኖል ፍሰት ሳይቶሜትሪ ይህ 0.2% ነበር። በተመሳሳይ ናሙና ላይ ሁለት መርማሪዎች እስከ 13 የመቶኛ ነጥቦች ድረስ ተለያይተዋል። የ2023 የሕያውነት ዘዴዎች ቁጥራዊ ንጽጽር፣ ፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፒና ፍሰት ሳይቶሜትሪ በእጅጉ የበለጠ ወጥነት ያላቸው መሆናቸውን አግኝቷል፤ በተመሳሳይ ጊዜም የዘዴው አፈጻጸም በዝርያውና በናሙናው ድብልቅ አካባቢ ላይ እንደሚመረኮዝ አሳይቷል። በፔንቲንግ እና ኪርሶፕ (PMID 24430080) የተዘጋጀው የታወቀ የዘዴ መግለጫ ዋና ማጣቀሻ ሆኖ ይቀጥላል። ይበልጥ ሰፊ የሆነው የእርሾ ሕያውነትና ንቁነት ምርመራዎች ግምገማ (PMID 25154541) ደግሞ ሜቲሊን ሰማያዊን ከወሳኝ ምርመራዎች ይልቅ ከተጓዳኝ ምርመራዎች መካከል ያስቀምጠዋል። ትራይፓን ሰማያዊ በዚህ ጉዳይ በቀጥታ የተሻለ ምርጫ አይሆንም፦ የሕዋስ ሽፋን ትክክለኛነት መጥፋትን ያሳያል፤ ሜቲሊን ሰማያዊ ግን ቀለሙን ወደ ሕዋስ ማስገባትንና የሪዳክሽን እንቅስቃሴን ያሳያል። ስለዚህ ጫና የደረሰባቸው ሕዋሳት በሁለቱ ቀለሞች የተለየ ምደባ ሊያገኙ ይችላሉ።

የትንፈሳ ሙከራ፦ ሰማያዊው ቀለም እስኪጠፋ ያለውን ጊዜ ይለኩ

ሁለተኛው ምርመራ ማይክሮስኮፕ ፈጽሞ አይጠቀምም። እርሾ፣ ግሉኮስ እና የተቀጠነ ሜቲሊን ሰማያዊ በተዘጋ ቱቦ ውስጥ ይገባሉ፤ ሰዓቱም ሰማያዊው ቀለም እስኪጠፋ ምን ያህል ጊዜ እንደሚወስድ ይለካል። ሕዋሳት ሜታቦሊዝም ሲያከናውኑ፣ ሰማያዊውን ቀለም ወደ ቀለም አልባ መልኩ የሚቀይሩ የሪዳክሽን አቅም ያላቸው አካላትን ያመነጫሉ፤ በፈሳሹ ውስጥ የሟሟ ኦክሲጅን ደግሞ እንደገና ኦክሲዴሽን በማድረግ ወደ ሰማያዊነት ይመልሰዋል። ሕዋሳቱ ኦክሲጅኑን ካሳነሱ በኋላ፣ አጠቃላይ ሚዛኑ ወደ ሪዳክሽን ያዘነብላል፣ ቱቦውም ቀለሙን ያጣል። ስለዚህ የመጨረሻ ነጥቡ በትንፈሳ፣ በቀለም ክምችትና በኦክሲጅን አቅርቦት መካከል ያለውን ሚዛን ያንጸባርቃል። እንደ ቀጥተኛ የሞለኪውላዊ ኦክሲጅን ፍጆታ ፍጥነት ሳይሆን፣ እንደ ሜቲሊን ሰማያዊ ሪዳክሽን ጊዜ ወይም ቀለም መጥፋት ጊዜ መዘገብ አለበት።

ጊዜው ለመለካት ምቹ በሆነ ክልል እንዲወድቅ፣ ከሕያውነት ምርመራ በጣም የበለጠ የተቀጠነ ቀለም ይጠቀሙ። የAQA A level አስፈላጊ ተግባራዊ ሙከራዎች መመሪያ ለዚህ ግልጽ ደረጃ ያስቀምጣል፦ በ100 mL ውሃ ውስጥ 1 g ግሉኮስ፣ ወደ 30 C ገደማ ማሞቅ፣ ከመጠቀም በፊት ወዲያውኑ 5 g ደረቅ እርሾ መጨመር፣ እና ከ1% መነሻ መፍትሔ 0.1 mL ወስዶ እስከ 100 mL በማቅጠን ወደ 0.001% የሚጠጋ ለሙከራ የሚውል ቀለም ማዘጋጀት። 2 mL የእርሾና ግሉኮስ እገዳ ከ2 mL ለሙከራ የሚውል ቀለም ጋር ያቀላቅሉ፣ ድብልቁ ከሙከራው ሙቀት ጋር እንዲመጣጠን ያድርጉ፣ አንድ ጊዜ ለ10 ሰከንዶች ያናውጡ፣ ጊዜ ቆጣሪውን ያስጀምሩ፣ እንደገናም አያናውጡ። ማናወጥ ኦክሲጅንን እንደገና ያስገባል፣ ቱቦውንም መልሶ ሰማያዊ ያደርገዋል፤ ይህ በአሠራሩ የሚፈጠር ከሁሉ ትልቁ የውጤት መዛባት ነው። AQA ድብልቁ በ35 C በተለምዶ በ5 ደቂቃዎች ገደማ ውስጥ ቀለሙን ሊያጣ እንደሚገባ ይጠቅሳል፤ የሙከራ አማካዮችም በ20 C 275 s፣ በ35 C 128 s፣ በ45 C 145 s ናቸው። እነዚህ ከአንድ የሙከራ አደረጃጀት የተገኙ ምሳሌዎች እንጂ ለሁሉም የሚሠሩ መመዘኛዎች አይደሉም። በተቆጣጠሩ ሁኔታዎች ውስጥ በሪዳክሽን ፍጥነትና ንቁ ሜታቦሊዝም ባለው እርሾ መካከል ያለው ቁጥራዊ ግንኙነት፣ በሪዳክሽን ላይ በተደረጉ ልዩ ጥናቶች ይደገፋል፤ እነዚህም በPMID 25773544 የተመዘገበውን ሥራ እና በYeast (2014) የታተመውን የአሠራር ሂደት ጥናት ያካትታሉ።

የጊዜ ሂደት ማሳያ (ለዚህ ጽሑፍ በተለይ የተዘጋጀ)

ከታች ያለው ሠንጠረዥ፣ ከላይ የተገለጸውን የAQA አይነት የሙከራ አደረጃጀት በመጠቀም ለዚህ ጽሑፍ በተለይ የተዘጋጀ ማሳያ ነው፦ 2 mL የእርሾና ግሉኮስ ድብልቅ ከ2 mL ወደ 0.001% ከሚጠጋ ለሙከራ የሚውል ቀለም ጋር፣ አንድ ጊዜ ለ10 ሰከንዶች ማናወጥ፣ ከዚያም ሳይነካ በሙከራው ሙቀት ማቆየት። የተመዘገቡት መረጃዎች የተማሪ ቡድን መመዝገብ በሚገባው ቅርጽ የቀረቡ ምሳሌ ንባቦች ናቸው፤ የፍጥነት መረጃ ጠቋሚው 1ን በሰከንዶች በተለካው የቀለም መጥፋት ጊዜ በማካፈል ይወሰናል። ተመሳሳይ ቱቦዎችን በመጠቀም ሙከራውን ያካሂዱና እነዚህን መረጃዎች በተለኩ እሴቶች ይተኩ።

ለA፣ B እና C ቱቦዎች የፍጥነት መረጃ ጠቋሚውን ከሙቀት ጋር በግራፍ ያሳዩ። ኩርባው መጀመሪያ ይወጣል፣ ከዚያም ይጠፍጥፋል ወይም ይወርዳል፤ ይህ በኢንዛይሞች ከሚመራ ሂደት የሚጠበቀው ቅርጽ እንጂ ቀጥተኛ መስመር አይደለም። D፣ E እና F ቱቦዎች በዚያ ኩርባ ላይ የሚቀመጡ የመረጃ ነጥቦች አይደሉም። ኩርባውን መተርጎም እንዲቻል የሚያደርጉ መቆጣጠሪያዎች ናቸው።

እያንዳንዱን ምርመራ ትርጉም ያለው የሚያደርጉ መቆጣጠሪያዎች

እያንዳንዱ የትንፈሳ ሙከራ ሦስት ተጓዳኝ መቆጣጠሪያዎች ያስፈልጉታል። የተቀቀለ ወይም የተገደለ እርሾ፣ ግሉኮስ እና ቀለም ያለበት ድብልቅ ሰማያዊ ሆኖ መቆየት አለበት፤ ይህም ፈጣን ሪዳክሽን በሕያው ሜታቦሊዝም ላይ እንደሚመረኮዝ ያረጋግጣል። ግሉኮስ ሳይጨመርበት ሕያው እርሾና ቀለም ያለበት ድብልቅ የምላሽ ግብዓት መቆጣጠሪያ ነው፤ ሆኖም እርሾ ውስጣዊ ክምችቶቹን ስለሚጠቀም፣ ቀስ በቀስ ቀለሙ እንዲጠፋ ይጠብቁ። እርሾ ሳይኖር ግሉኮስና ቀለም ብቻ ያለበት ድብልቅ ኬሚካላዊ ባዶ መቆጣጠሪያ ነው። በአልካላይን ሁኔታ ያለ ግሉኮስ ምንም ሕዋሳት ሳይኖሩ ሜቲሊን ሰማያዊን ሪዳክሽን ማድረግ ስለሚችል፣ ይህ መቆጣጠሪያ አስፈላጊ ነው።

የሕያውነት ቆጠራ የተለየ አይነት መቆጣጠሪያ ይፈልጋል፦ የአሠራር ወጥነት። ተመሳሳይ የቀለም መነሻ መፍትሔ፣ ተመሳሳይ የማቀላቀል ሬሾ፣ ተመሳሳይ የቀለም መቀባት ጊዜ ክፍተት፣ ተመሳሳይ የቆጠራ ክፍል ቦታ፣ ተመሳሳይ የቡቃያና የድንበር ደንቦች፣ እና ከተቻለ የናሙናውን ማንነት ሳያውቁ መቁጠር። የሁለት መርማሪዎች ውጤቶች በአሥር ነጥቦች ሲለያዩ፣ መመዝገቢያው ብዙውን ጊዜ ምክንያቱን ያሳያል፦ የተለየ ጊዜ፣ የተለየ የሰማያዊነት መለያ ገደብ፣ ወይም የተለዩ የቡቃያ ደንቦች። ቀለም የተቀቡ ሕዋሳትን የማዘጋጀትና የመመልከት ቴክኒኮች ከቀላል የባክቴሪያ ማቅለም ዘዴዎች ጋር ይያያዛሉ። ቀለሙ በተለያዩ ናሙናዎች ውስጥ ምን እንደሚያመለክት የሚያሳይ ሰፋ ያለ ዳሰሳ ደግሞ በማይክሮስኮፒ ማቅለም አትላስ ውስጥ ይገኛል። ማንኛውንም የሰማያዊ ቀለም ጥንካሬ በቁጥር ከመለካት ጀርባ ስላለው ፊዚክስ፣ ሁኔታዎቹ የተገለጹበት የብርሃን መምጠጥ ማጣቀሻ እያንዳንዱ የመምጠጥ አባዢ ለምን ከሟሟው፣ ከpHው እና ከክምችት ሁኔታዎቹ ጋር መቅረብ እንዳለበት ያብራራል።

ምርመራውን በጥያቄው መሠረት ይምረጡ። አሁን ስንት ሕዋሳት ሕያው ናቸው የሚለው የቆጠራ ጥያቄ ነው፣ በማይክሮስኮፕና በመመዝገቢያ ይመለሳል። ይህ የእርሾ ባህል ምን ያህል ንቁ ትንፈሳ እያከናወነ ነው የሚለው ደግሞ የምላሽ ፍጥነት ጥያቄ ነው፣ በጊዜ ቆጣሪና በተቆጣጠሩ ቱቦዎች ይመለሳል። ሜቲሊን ሰማያዊ ለሁለቱም ያገለግላል፣ ነገር ግን በአንድ ቱቦ ውስጥ በአንድ ጊዜ ለሁለቱም ፈጽሞ አያገለግልም።