በሜቲሊን ብሉ ሙከራዎች ውስጥ ምላሽ ሰጪ የኦክስጅን ዝርያዎችን መለካት

ሁለት ላቦራቶሪዎች እያንዳንዳቸው የሜቲሊን ብሉ ኦክሲዴሽን መከላከል ሙከራ ብለው የሚጠሩትን ያካሂዳሉ። አንዱ ማቅለሚያው ምላሽ ሰጪ የኦክስጅን ዝርያዎችን እንደሚቀንስ ይዘግባል። ሌላው ደግሞ እንደሚያመነጫቸው ይዘግባል። ሁለቱም ግልጽ የመጠንና ምላሽ ግንኙነት ኩርባዎችን ያሳያሉ። ሁለቱም በቅንነት ነው የሚሠሩት። ልዩነቱ የማጭበርበር ወይም የብቃት ማነስ ጉዳይ አይደለም። ሁለቱ ቡድኖች በተለያየ ብርሃን ሥር፣ የተለያዩ ጥያቄዎችን በሚመልሱ መርማሪ ተዋህዶዎች፣ የተለያዩ ነገሮችን ለክተው፣ ከዚያም ሁለቱንም መልሶች በአንድ ቃል፣ ROS፣ መግለጻቸው ነው።

ሜቲሊን ብሉ በትክክል ለመለካት አስቸጋሪ ሞለኪውል የሆነው፣ ሊታዘብ በሚገባው ኬሚካላዊ ሂደት ውስጥ ራሱ ስለሚሳተፍ ነው። በጨለማ ውስጥ ኤሌክትሮኖችን በለጋሾችና በተቀባዮች መካከል ያጓጉዛል፣ ከዚያም ዑደቱን ለመድገም ዝግጁ ሆኖ ወደ መጀመሪያው ቅርጽ ይመለሳል። በብርሃን ሥር ግን የብርሃን አነቃቂ ይሆናል፤ ወደ ተነቃቃ ትሪፕሌት ሁኔታ ይደርሳል፣ ከዚያም ለኦክስጅን ኃይል በማስተላለፍ ሲንግሌት ኦክስጅንን፣ ወይም ኤሌክትሮኖችን በማስተላለፍ ራዲካሎችንና ሃይድሮጅን ፐሮክሳይድን ሊያመነጭ ይችላል። በዚያ ሥርዓት ውስጥ የሚጨመር ማንኛውም መርማሪ ተዋህዶ በማቅለሚያው ራሱ ኦክሲዴሽን፣ ሪዳክሽን ወይም መንጣት ሊደርስበት፣ ወይም የብርሃን ምልክቱ ሊሸፈን ይችላል። ስለዚህ ለማንኛውም የROS ንባብ የመጀመሪያው ጥያቄ ቁጥሩ ስንት እንደሆነ ፈጽሞ አይደለም። መለኪያ ፈተናው በእውነት ምን እንደሚያገኝ እና ማቅለሚያው በመለኪያ ፈተናው ላይ ምን እንደሚያደርግ ነው።

Amplex Red፦ ካሊብሬሽን የተደረገለት የሃይድሮጅን ፐሮክሳይድ መለኪያ ፈተና

የሜቲሊን ብሉ እና Amplex Red ጥምረት፣ በትክክል ሲዘጋጅ፣ በዚህ ዘርፍ ሥነ ጽሑፍ ውስጥ በማስረጃ ለመደገፍ ከሁሉ የሚሻለው ጥምረት ነው። ኬሚካላዊ ሂደቱ የተወሰነ ነው፦ የፈረስ ራዲሽ ፐሮክሲዴዝ ሃይድሮጅን ፐሮክሳይድን በመጠቀም የAmplex ሰብስትሬትን ኦክሲዳይዝ ያደርገዋል፣ በግምት አንድ ለአንድ ስቶይኪዮሜትሪ ውስጥም ፍሎረሰንስ የሚሰጥ ሬዞሩፊን የተባለ ምርት ይፈጠራል። ከናሙናው የሚመጣው ፐሮክሳይድ በማወቂያ መሣሪያው ውስጥ ወደ ፍሎረሰንስ ይቀየራል። በተለምዶ በROS ቤተሰብ ውስጥ ከሚመደቡት ነገሮች መካከል ሌላ ማንኛውም ይህን ምላሽ በቀጥታ አያስኬድም።

ወሳኙ ጥቅም ካሊብሬሽን ነው። ጥንቃቄ ያለው ተመራማሪ የታወቀ መጠን ያላቸውን የፐሮክሳይድ መደበኛ መፍትሔዎች በተመሳሳይ ቡፈር፣ በተመሳሳይ የፐሮክሲዴዝና የሰብስትሬት ክምችት፣ በተመሳሳይ የማቆያ ጊዜ እና በተመሳሳይ የኦፕቲክስ ቅንብሮች ይፈትናል፤ ከዚያም የናሙናዎቹን ንባቦች ከዚያ ኩርባ ጋር በማነጻጸር ይወስናል። ለዚህ ዘዴ መሠረት በሆነው፣ ተለይተው በወጡ የአንጎል ሚቶኮንድሪያዎች ላይ በተደረገው ጥናት፣ ደራሲዎቹ ይህንኑ አደረጉ። በእያንዳንዱ ሙከራ መጨረሻ የታወቀ መጠን ያለው ፐሮክሳይድ ጨመሩ፣ ውጤቶቹም በዘፈቀደ የፍሎረሰንስ አሃዶች ሳይሆን፣ በአንድ ሚሊግራም ፕሮቲን በደቂቃ በሚመነጩ ፒኮሞሎች ፍጥነት ተዘገቡ። ብርሃንን ወደ መለኪያ የሚቀይረው ይህ ነው።

ከዚያ ጥናት ሦስት ዝርዝሮች ሊከተሉ ይገባል። በመጀመሪያ፣ ደራሲዎቹ ፐሮክሳይድን በሚያፈርሰው ካታሌዝ አማካይነት ምልክቱን አረጋገጡ። ካታሌዝ ሲጨመር፣ በሜቲሊን ብሉ ምክንያት የታየው የፍሎረሰንስ ጭማሪ ቆመ፤ ይህም ምልክቱ ከኦፕቲክስ የመጣ አርቴፋክት ሳይሆን ፐሮክሳይድ መሆኑን አረጋገጠ። ሁለተኛ፣ ናሙናዎቹ ከመደበኛው የብርሃን መጠን አንድ ስምንተኛውን ብቻ እንዲቀበሉ የማነቃቂያ ጨረሩን በመዝጋት የብርሃን ተጽእኖን በቀጥታ ፈተኑ፣ ምልክቱም በዘጠኝ በመቶ ብቻ ቀነሰ። ከዘገቡት ፐሮክሳይድ ውስጥ ከዘጠና በመቶ በላይ የሚሆነው ከመለኪያው ብርሃን ገለልተኛ ነበር። ሦስተኛ፣ የፐሮክሳይድ መወገድን በኤሌክትሮድ ለይተው ለኩ፣ ማቅለሚያውም ምርቱን እንደሚጨምር እና መወገዱን እንደሚያዘገይ አገኙ። የተጣራውን ፍሎረሰንስ ብቻ የሚዘግብ መርማሪ ተዋህዶ እነዚህን ሁለት ተጽእኖዎች አንድ ላይ ባቀላቀላቸው ነበር።

መለኪያ ፈተናው አሁንም ሊሳሳትባቸው የሚችሉ ሁኔታዎች አሉት፣ ሜቲሊን ብሉም ከእነዚህ በርካታዎቹን ያስከትላል። ማቅለሚያው ሬዞሩፊን ብርሃን በሚያወጣበት በዚያው የቀይ ሞገድ ክልል ውስጥ በሰፊው ይወስዳል። ስለዚህ የማቅለሚያው ክምችት ከፍ ሲል፣ ናሙናው በውስጣዊ ማጣሪያ ተጽእኖ የራሱን ምልክት ሊሸፍን ይችላል። መደበኛ መፍትሔዎቹም ስለዚህ ከናሙናዎቹ ጋር ተመሳሳይ የማቅለሚያ ክምችት ሊኖራቸው ይገባል። Amplex Red በራሱም በብርሃን ኦክሲዳይዝ ሊሆን ይችላል፤ ምርቱ ሬዞሩፊንም ሱፐርኦክሳይድና ፐሮክሳይድ የሚያመነጭ የብርሃን ሬዶክስ ዑደት ውስጥ ሊገባ ይችላል። ሙከራው የብርሃን አነቃቂንም ለብርሃን ሲያጋልጥ፣ ይህ ከፍተኛ አስፈላጊነት አለው። ተግባራዊው መፍትሔ፣ ማቅለሚያውንና መርማሪ ተዋህዶውን በአንድ ላይ ከማብራት ይልቅ፣ መጀመሪያ የሜቲሊን ብሉ ናሙናዎችን ለብርሃን ማጋለጥ፣ ከዚያም የተወሰዱ ክፍል ናሙናዎችን በAmplex ሪኤጀንቶች በጨለማ መፈተን ነው። በመጨረሻ፣ ሱፐርኦክሳይድ ዲስሙቴዝ የAmplex ምልክትን ዝም ብሎ አይቀንስም፤ ሱፐርኦክሳይድን ወደ ፐሮክሳይድ መቀየር ምልክቱን ሊጨምረው ይችላል። ፍሎረሰንስን የሚጨምር የSOD መቆጣጠሪያ አልተሳካም ማለት አይደለም። ሱፐርኦክሳይድ በምላሹ ቀዳሚ ደረጃ ያለ ዝርያ መሆኑን ለይቷል ማለት ነው።

DCFDA፦ የተወሰነ ኦክሲዳንትን የማይለይ የኦክሲዴሽን አመልካች

የሜቲሊን ብሉ እና DCFDA ጥምረት የአብዛኛው ግራ መጋባት ምንጭ ነው። DCFH-DA ወደ ሕዋስ የሚገባ ቅድመ ተዋህዶ ነው። በሕዋሱ ውስጥ ያሉ ኤስተሬዞች የአሴቴት ቡድኖቹን ያስወግዳሉ፣ ፍሎረሰንስ የማይሰጥ DCFHም ይቀራል። DCFH ኦክሲዳይዝ ሲሆን ፍሎረሰንስ የሚሰጥ DCF ይፈጠራል። ኦክሲዳይዝ የሚያደርጉት ነገሮች ዝርዝር ረጅም ነው፦ ሃይድሮክሲል ራዲካሎች፣ የፐሮክሲዴዝና የሂም መካከለኛ ምርቶች፣ ናይትሮጅን ዳይኦክሳይድ፣ ሃይፖክሎረስ አሲድ እና ከፐሮክሲናይትራይት የሚመነጩ ራዲካሎች። ሃይድሮጅን ፐሮክሳይድ ብቻውን በጠቃሚ ፍጥነት በቀጥታ ኦክሲዳይዝ አያደርገውም፤ በፐሮክሳይድ ላይ የሚመረኮዝ ፍሎረሰንስ በአጠቃላይ በሂደቱ ውስጥ ብረት፣ የሂም ፕሮቲኖች ወይም የፐሮክሲዴዝ ኬሚካላዊ ምላሽ እንዲኖር ይፈልጋል።

እያንዳንዱ የዘዴዎች ክፍል ሊጠቅሰው የሚገባ ትችት፣ ካሊያናራማን እና ባልደረቦቹ DCFHን እንደ መርማሪ ተዋህዶ ከተነተኑበት ሥራ ይመጣል። በዚህ ምክንያት DCFDAን ውድቅ ባደረገው የአንጎል ሚቶኮንድሪያ ጥናት እንደተጠቃለለው፣ እነዚህ ተመራማሪዎች ማቅለሚያው በዝግታ፣ ባልተለየ ስቶይኪዮሜትሪ፣ ያለ ትክክለኛ ካሊብሬሽን፣ እንዲሁም ROS ካልሆኑ ተዋህዶዎች ጋር ምላሽ እንደሚሰጥ አሳይተዋል። መርማሪ ተዋህዶው የሚለካውንም ያጎላል፦ በአንድ ኤሌክትሮን የሚከናወን የDCFH ኦክሲዴሽን፣ ከኦክስጅን ጋር ምላሽ ሰጥቶ ሱፐርኦክሳይድ የሚያመነጭ የDCF ራዲካል ይፈጥራል፤ ሱፐርኦክሳይዱም በዲስሙቴሽን ተጨማሪ ፐሮክሳይድ ያመነጫል። ንባቡ የሚዘግበውን ኬሚካላዊ ሂደት በከፊል ራሱ ይፈጥራል።

ከዚህ ሁሉ ውስጥ ማንኛውም DCFDAን ጥቅም የለሽ አያደርገውም። የማጣሪያ ፈተና እንጂ የመለያ ፈተና እንዳልሆነ ያሳያል። የDCF ፍሎረሰንስ መጨመር፣ በኦክሲዳንት ላይ የሚመረኮዘው የመርማሪ ተዋህዶ ኦክሲዴሽን ጨምሯል ማለት ነው። ፐሮክሳይድ ጨምሯል ማለት አይደለም፣ በእርግጠኝነትም ጠቅላላ ROS ጨምሯል ማለት አይደለም፤ ይህን መጠን ማንኛውም አንድ መርማሪ ተዋህዶ ብቻውን አይለካም። ከአንድ ማይክሮሞላር በላይ ባለ ክምችት በDCF ኦክሲዴሽን ላይ የተመረኮዘ ቀደምት የሜቲሊን ብሉ ሥራ ኦክሲዴሽንን የሚያበረታቱ ተጽእኖዎችን ዘግቧል። በዚያው ዘመን ሌሎች ሥርዓቶች ግን በፐሮክሳይድ ከሚከሰት የሕዋስ ሞት መከላከልን ዘግበዋል። በተለያዩ የሬዶክስ ሁኔታዎች ውስጥ ሁለቱም ምልከታዎች ለተመሳሳይ ማቅለሚያ እውነት ሊሆኑ ይችላሉ፣ የDCF ውጤት ብቻውንም ምልክቱን ያስከተለው የትኛው ኦክሲዳንት እንደሆነ ሊገልጽ አይችልም። ቀደምት የአንጎል ሚቶኮንድሪያ ሥራ አስፈላጊ የሚሆነው፣ ይህን የማጣሪያ ፈተና በካሊብሬሽን በተደገፈ የፐሮክሳይድ መለኪያ በመተካት የፐሮክሳይድ ሸክሙን በቀጥታ ስላገኘ ነው። አንድ መቶ ናኖሞላር ማቅለሚያ እንኳን፣ በተፈተኑት ሁሉም ሰብስትሬቶችና የሴሉላር መተንፈስ ሁኔታዎች ውስጥ፣ የፐሮክሳይድ መለቀቅን በብዙ እጥፍ ጨምሯል።

DCFDA ለሜቲሊን ብሉ የተለየ ሌላ አንድ ወጥመድ አለው። ማቅለሚያው ጠንካራ ቀለም ያለውና በሬዶክስ ምላሾች የሚሳተፍ ስለሆነ፣ ፍሎረሰንስን ሊያነጣ፣ የብርሃን ልቀትን ሊያዳክም፣ ወይም ከሕዋስ ROS ገለልተኛ በሆነ መንገድ የመርማሪ ተዋህዶውን ኦክሲዳይዝ ሊያደርግ ይችላል። ማቅለሚያና መርማሪ ተዋህዶ ያሉበት፣ ነገር ግን ሕዋሶች የሌሉበት መቆጣጠሪያ የአማራጭ ማስዋቢያ አይደለም። ማቅለሚያው ከመርማሪ ተዋህዶው ጋር ግንኙነት እንዳለው የሚነግርዎት ሙከራ ነው።

ስፒን ማጥመድ እና የኦክስጅን ፍጆታ፦ ማንነት እና ፍሰት

ፍሎረሰንስ የሚሰጡ መርማሪ ተዋህዶዎች ኦክሲዳይዝ ሊሆን የሚችል ነገር መታየቱን ሲዘግቡ፣ የስፒን ወጥመዶችን የሚጠቀም የኤሌክትሮን ስፒን ሬዞናንስ ያ ነገር ምን እንደነበር ለመግለጽ የቀረበ መረጃ ይሰጣል። ታዋቂው የሜቲሊን ብሉ የብርሃን ኬሚስትሪ ጥናት፣ ከማቅለሚያ፣ ከአስኮርቤት እና ከብርሃን የሚመነጨውን የአስኮርቤት ራዲካል ለማወቅ ESRን ተጠቅሟል። ከዚያም በኦክስጅን ፍጆታ ሙከራዎች የፐሮክሳይድ መፈጠርን፣ በስፒን ማጥመድ ሙከራዎች ደግሞ በብረት ካታሊሲስ የሚከናወን የሃይድሮክሲል ራዲካል መፈጠርን አሳይቷል። እያንዳንዱ ዘዴ ሌሎቹ ሊመልሱት ያልቻሉትን ጥያቄ መልሷል፦ ESR የራዲካሉን ማንነት ገልጿል፣ የኦክስጅን ፍጆታ ከማንኛውም ፍሎረሰንስ ሰጪ መርማሪ ተዋህዶ ገለልተኛ የሆነ የምላሽ ፍሰት መረጃ ሰጥቷል፣ ጥምረቱም በተመሳሳይ ለብርሃን በተጋለጠ ሥርዓት ውስጥ የሲንግሌት ኦክስጅንና የራዲካል መንገዶች ሁለቱም እየሠሩ መሆናቸውን አሳይቷል።

ያ የ1984 ውጤት አሁንም እንደ ማስጠንቀቂያ ምልክት ይነበባል። ብርሃንና ሪዳክሽን አድራጊ ሲኖሩ፣ ማቅለሚያው ፐሮክሳይድ አመነጨ፤ ብረት ሲኖርም ሥርዓቱ ከዚህ ስብስብ ውስጥ ከሁሉ በላይ ምላሽ ሰጪ የሆነውን ሃይድሮክሲል ራዲካል ፈጠረ። ደራሲዎቹ ይህን በዓይን ውስጥ ካለው አስኮርቤት ጋር አያይዘው፣ በዓይን ላይ ያለ በቂ ጥንቃቄ መጠቀምን ጥያቄ ውስጥ አስገቡ። የዛሬ አንባቢዎች ሁኔታዎቹን ልብ ሊሉ ይገባል፦ ብርሃን ከሪዳክሽን አድራጊ እና ከብረት ጋር። ከእነዚህ አንዱን ካስወገዱ፣ መንገዱ ይዳከማል ወይም ይጠፋል።

የኦክስጅን ኤሌክትሮዶች ጠቀሜታቸውን በሌላ መንገድ ያረጋግጣሉ። የClark ዓይነት ኤሌክትሮድ የተጣራ የኦክስጅን ፍጆታን ይለካል። ይህም በማቅለሚያው የሚነዳው የሬዶክስ ኬሚካላዊ ሂደት ሞለኪውላዊ ኦክስጅንን እየተጠቀመ መሆኑን ያረጋግጣል፣ ማንኛውም የፍሎረሰንስ አርቴፋክት ሊያስመስለው የማይችል የምላሽ ፍጥነት መረጃም ይሰጣል። ምርቱን ግን አይለይም። የፐሮክሳይድ፣ የሱፐርኦክሳይድና የውሃ መፈጠር፣ እንዲሁም የሲንግሌት ኦክስጅን መበስበስ፣ ሁሉም ኦክስጅን ይጠቀማሉ። ማንነት የሌለው ፍሰት፣ ፍሰት እንደሌለው ማንነት፣ ያልተሟላ ነው። ጠንካራ ጥናቶች ኤሌክትሮዱን ካሊብሬሽን ከተደረገለት የፐሮክሳይድ መለኪያ ፈተና ወይም ከወጥመድ ጋር የሚያጣምሩት ለዚህ ነው።

የኦክሲዴሽን መከላከል ውጤቶች ለምን ይቃረናሉ?

ሦስቱን ንባቦች ጎን ለጎን ሲያስቀምጡ፣ በሜቲሊን ብሉ ሥነ ጽሑፍ ውስጥ የሚታዩት ተቃርኖዎች በዘዴ ልዩነቶችና በሦስት ባዮሎጂያዊ እውነታዎች ይብራራሉ።

በመጀመሪያ፣ ማቅለሚያው የኤሌክትሮን አጓጓዥም የፐሮክሳይድ ምንጭም ነው። ኦክስጅን ወደ ሱፐርኦክሳይድ ከሚቀየርባቸው የሴሉላር መተንፈስ ቦታዎች ኤሌክትሮኖችን በማዞር አንድን ROS ሊቀንስ ይችላል። በዚያው ጊዜ ሪዳክሽን የተደረገለት ቅርጹ ኦክስጅንን በቀጥታ ወደ ፐሮክሳይድ በመቀየር ሌላውን ይጨምራል። የሚቶኮንድሪያ ሬዶክስ ኬሚስትሪን እና የማቅለሚያውን የአማራጭ መንገድ ሚና የሚመረምር ላቦራቶሪ ስለዚህ በመርማሪ ተዋህዶው የሚለያዩ መልሶችን መጠበቅ አለበት፦ በተመሳሳይ ኪዩቬት ውስጥ፣ ለሱፐርኦክሳይድ ስሜታዊ የሆነ ንባብ ሲቀንስ፣ የፐሮክሳይድ ንባብ ይጨምራል።

ሁለተኛ፣ ፐሮክሳይድ በዝቅተኛ መጠን ሲኖር ጉዳት ብቻ ሳይሆን ምልክት ነው። ቀደምት ሥራውን ተከትሎ የተደረገው የአይጥ አንጎል ሚቶኮንድሪያ ጥናት፣ እስከ ሃምሳ ናኖሞላር ዝቅተኛ የሆነ የማቅለሚያ መጠን ፐሮክሳይድ እንደሚያመነጭ፣ በሕክምና ደረጃዎች ግን በሚቶኮንድሪያ DNA ላይ ጉዳት እንደማያስከትል አገኘ። በቅድሚያ ከተሰጠ በኋላም በሮቴኖን ከሚፈጠር ጉዳት መከላከል ታየ። ከሕክምና ክልሉ እጅግ ከፍ ባለው በአንድ መቶ ማይክሮሞላር ብቻ ማቅለሚያው በተመረጡ የDNA ቁርጥራጮች ላይ ጉዳት አደረሰ። ቀይ ብርሃን ከሃያ ማይክሮሞላር ማቅለሚያ ጋር ደግሞ ሲንግሌት ኦክስጅን ፈጠረ፣ ይህም በተፈተኑት ሁሉም ቁርጥራጮች ላይ ጉዳት አደረሰ። የቀረበው የአሠራር ማብራሪያ ሆርሜቲክ ነው፦ መለስተኛ የፐሮክሳይድ ምርት፣ ከNrf2 ጋር የተያያዙ የኦክሲዴሽን መከላከያዎችንና የሚቶኮንድሪያ አዲስ መፈጠርን ያነሳሳል። ስለዚህ የአጭር ጊዜ ኦክሲዴሽን ማበረታታት ንባብ፣ የረዥም ጊዜ ኦክሲዴሽን መከላከል ውጤትን ይቀድማል። ከአንድ ሰዓት በኋላ የተነበበ መለኪያ ፈተና እና ከአንድ ቀን በኋላ የተነበበ መለኪያ ፈተና፣ በመካከላቸው ባዮሎጂያዊው ሁኔታ ስለተቀየረ፣ ሊቃረኑ ይችላሉ።

ሦስተኛ፣ ብርሃን የትኛው ሞለኪውል እንኳን እንደሚኖር ይወስናል። ለብርሃን ማጋለጥ ከማቅለሚያው የሜቲል ቡድኖችን በማስወገድ ወደ Azure B እና ወደ ተዛማጅ ምርቶች ይቀይረዋል። በሳህን ላይ ያለ የማይክሮስኮፕ መብራትም የብርሃን አነቃቂ እንዲሆን ለማድረግ በቂ ነው። በጨለማና በብርሃን የሚደረጉ ሙከራዎች የተለያዩ ሙከራዎች ናቸው። የማንኛውም ፕሮቶኮል የብርሃን እና የማቅለሚያ አያያዝ መቆጣጠሪያዎች ክፍልም እንደዚያ ሊያያቸው ይገባል።

ዝቅተኛው አስፈላጊ የመቆጣጠሪያ ስብስብ እና ማንኛውንም አባባል እንዴት መገምገም እንደሚቻል

ከታች ያለው ንጽጽር ለዚህ ጽሑፍ የተዘጋጀ ዋናው የማጣቀሻ ሰንጠረዥ ነው። ማንኛውንም የሜቲሊን ብሉ ROS ውጤት ከመቀበልዎ በፊት፣ ደራሲዎቹ የትኛውን ረድፍ እንደሞሉ እና የትኛውን እንደዘለሉ ያረጋግጡ።

ከዚህ ተግባራዊ የንባብ መርህ ይከተላል። ከፐሮክሲዴዝ ጋር የተጠቀመ፣ ካሊብሬሽን የተደረገለት እና በካታሌዝ የተረጋገጠ Amplex፣ ስለ ፐሮክሳይድ ማስረጃ ነው። DCFDA የተወሰነ ኦክሲዳንትን ስለማይለይ የመርማሪ ተዋህዶ ኦክሲዴሽን ማስረጃ ነው፣ ከዚያ በላይ ምንም አይደለም። ራዲካሎችን የሚያስወግዱ ንጥረ ነገሮችን እንደ መቆጣጠሪያ የሚጠቀም ስፒን ማጥመድ፣ ስለ ራዲካል ማንነት ማስረጃ ነው። የኦክስጅን ፍጆታ ስለ ፍሰት ማስረጃ ነው። መለኪያ ፈተናው ሊደግፈው ከሚችለው በላይ የሚናገር ዐረፍተ ነገር፣ ምንም ያህል በእርግጠኝነት ቢጻፍ፣ ስለ ማቅለሚያው ሳይሆን ስለ መርማሪ ተዋህዶው የሚናገር ዐረፍተ ነገር ነው። በመጠን ላይ ስለመመርኮዝና ስለ ሆርሜቲክ ክልል፣ ስለ ሚቶኮንድሪያ ኤሌክትሮን ፍሰት፣ በቀለም በተነከሩ ናሙናዎች ውስጥ ስለሚከሰት የመለኪያ ፈተና ጣልቃ ገብነት እና በማይክሮስኮፕ ብርሃን ስለሚፈጠሩ አርቴፋክቶች የሚያብራሩ ተዛማጅ ውይይቶች፣ እያንዳንዱን ነጥብ ያስፋፋሉ። ጊዜያዊው የማጣቀሻ ቦታ ያዥ ከተተካ በኋላም እያንዳንዱ ነጥብ ትክክለኛ ሆኖ ይቀጥላል።