የሜቲሊን ብሉ የመለኪያ ማስተካከያ ኩርባ መገንባት፦ ባዶ ማጣቀሻዎች፣ ክልል እና መስመራዊነት

ሁለት ተንታኞች ከአንድ የሜቲሊን ብሉ መነሻ መፍትሔ ጠርሙስ ይጠቀማሉ፤ እያንዳንዳቸውም የመለኪያ ማስተካከያ ኩርባ ይገነባሉ። የመጀመሪያው ተንታኝ በመነሻ ነጥቡ የሚያልፍ ቀጥታ መስመር ያገኛል፣ ያልታወቀ ክምችት ያላቸውንም ናሙናዎች በእምነት ይለካል። ሁለተኛው ግን በላይኛው ጫፍ የሚታጠፍ መስመር፣ ወደ ዜሮ የማይጠጋ የዘንግ መቆራረጫ እና ናሙናው ሲሟሟ የሚለዋወጡ ውጤቶች ያገኛል። ቀለሙ፣ መሣሪያው እና የሞገድ ርዝመቱ አንድ ናቸው። ልዩነቱ በችሎታ አይደለም። በእቅዱ ነው፦ ባዶ ማጣቀሻው ምን እንደያዘ፣ የትኞቹ ክምችቶች እንደተመረጡ እና የተፈተሸው ክልል አንድ ቀላል ሞዴል አሁንም በሚሠራበት ወሰን ውስጥ እንደቆየ ነው።

የመለኪያ ማስተካከያ ኩርባ በመሣሪያ ምላሽ እና በክምችት መካከል ያለ ስምምነት ነው፤ የሚሠራውም በተገነባበት ሁኔታ ብቻ ነው። ለሜቲሊን ብሉ ይህ ስምምነት የታወቀ ደካማ ጎን አለው። የቀለሙ ሞለኪውሎች በውሃ ውስጥ እርስ በርሳቸው ይተሳሰራሉ፣ ስለዚህ ብርሃን የሚመጥጠው ኬሚካላዊ ቅርጽ ከክምችቱ ጋር ይለዋወጣል። ይህን ለውጥ አቋርጦ የሚገነባ ኩርባ ቀጥታ አይሆንም፣ ምንም ያህል የስታቲስቲክስ ትንተና ቢደረግም ይህን ማስተካከል አይቻልም። ይህ ጽሑፍ መስመሩ ትርጉም እንዲኖረው ኩርባውን እንዴት ማቀድ እንደሚቻል ያሳያል፦ ትክክለኛውን ባዶ ማጣቀሻ ይምረጡ፣ ክልሉን ሞኖመር በሚበዛበት ወሰን ውስጥ ያቆዩ፣ ተደጋጋሚ ሙከራዎችን በትክክል ያዘጋጁ፣ መጣመምንም እንደ መረጃ እንጂ እንደ ድምፀት አይመልከቱት።

ከመደበኛ መፍትሔዎቹ ሳይሆን ከባዶ ማጣቀሻው ይጀምሩ

ባዶ ማጣቀሻው ዜሮን ይወስናል፤ ለሜቲሊን ብሉም ከቀለሙ በስተቀር ሁሉንም ነገር መያዝ አለበት። ተመሳሳይ የውሃ ደረጃ፣ ተመሳሳይ ባፈር እና pH፣ ተመሳሳይ ጨዎች፣ ተመሳሳይ የተጨማሪ ሟሟ ድርሻ እና ተመሳሳይ ሙቀት። የመለኪያ ማስተካከያ መፍትሔዎቹን በዚያው ተመሳሳይ ማትሪክስ ውስጥ ያዘጋጁ። ምክንያቱ ኬሚካላዊ ነው እንጂ ቢሮክራሲያዊ አይደለም። ጨው እና ሟሟ በሞኖመር፣ በዳይመር እና በከፍተኛ ስብስቦች መካከል ያለውን ሚዛን ይቀይራሉ፤ ይህም በመለኪያው የሞገድ ርዝመት ላይ ስፔክትረሙን ይለውጣል። ውሃ ብቻ የያዘ ባዶ ማጣቀሻ፣ ማትሪክሱ በኬሚካላዊ ቅርጾች ስርጭት ላይ የሚያመጣውን ለውጥ ማስተካከል አይችልም። በክፍት ተደራሽ መዝገቡ ማግኘት የሚቻለው በውሃ ውስጥ ያሉ የሜቲሊን ብሉ ስፔክትረሞች አጠቃላይ ትንተና የሶዲየም ክሎራይድ ክምችትን ከ0 እስከ 0.15 M ቀይሯል። ይህ የተደረገው የአዮን ጥንካሬ ሚዛኑን ስለሚቀይር ሲሆን፣ ጨው ሲጨምር መሰባሰብም ጨምሯል።

አንድ ተግባራዊ ውጤት፦ በአዮን-አልባ ውሃ የመለኪያ ማስተካከያ አድርገው፣ ከዚያ በፎስፌት ባፈር ወይም በተጣራ ፍሳሽ ውሃ ውስጥ ያሉ ናሙናዎችን ፈጽሞ አይለኩ። የሚተነተነውን ንጥረ ነገር ያልያዘ ማትሪክስ ከሌለ፣ በናሙናው ራሱ ውስጥ መደበኛ መጠን የመጨመር ዘዴ ከማትሪክሱ ጋር ካልተዛመደ ውጫዊ ኩርባ ይሻላል። በውሃ መሠረት የሚደረጉ መጠናዊ ምርመራዎችን ትክክለኛ ለማድረግ የሚረዱ ተዛማጅ መመሪያዎች በማትሪክስ እና በጣልቃ ገብነት ውይይት ውስጥ ይገኛሉ፤ የቀለም መጠናዊ ምርመራዎች አጠቃላይ መርሆች ደግሞ በምርመራ እቅድ አጠቃላይ መግለጫ ውስጥ ተሸፍነዋል።

አንድ ኬሚካላዊ ቅርጽ የሚበዛበትን ክልል ይምረጡ

በ664 nm አቅራቢያ ባለው ረዥም የሞገድ ርዝመት ባንድ መጠንን መወሰን፣ አብዛኛው ቀለም በሞኖመር ቅርጽ እንዳለ ይገምታል። በተራ ውሃ ውስጥ ይህ ግምት የሚሠራው መፍትሔዎቹ የተሟሟ ሆነው ሲቆዩ ብቻ ነው፣ በግምትም በዝቅተኛው የማይክሮሞላር ክልል ውስጥ። በሙከራ የተገኙና የታተሙ የመስመር ተዳፋቶች ወሰኑን ያሳያሉ፦ በ1 cm ሴሎች ውስጥ ከ7 ማይክሮሞላር ገደማ በታች የተያዙ የመለኪያ ማስተካከያዎች ወደ 82,000 M-1 cm-1 የሚጠጋ ተዳፋት ይሰጣሉ። እስከ 37 ማይክሮሞላር ገደማ የተዘረጋ የመለኪያ ማስተካከያ ግን ወደ 67,100 ገደማ ይወርዳል፣ ምክንያቱም የላይኛዎቹ መደበኛ መፍትሔዎች ቀድሞውኑ ጉልህ የዳይመር መጠን ይይዛሉ። እዚህ የተጠቀሰ እያንዳንዱ ቅንጅት የተገኘበት ሁኔታ በሜቲሊን ብሉ ስፔክትራል ማጣቀሻ ውስጥ ተገልጿል። ቁጥሮችን ለማነጻጸር ትክክለኛው ቦታ ያ ነው፤ ይህ ጽሑፍ የሚጠቀምባቸው ክልሉን ለመወሰን ብቻ ነው።

የእቅድ መመሪያዎቹ በቀጥታ ከዚህ ይከተላሉ፦

1. የስፔክትረሙ ቅርጽ እንዳይለወጥ፣ ከፍተኛውን መደበኛ መፍትሔ በቂ የተሟሟ ያድርጉት። ዘዴውን በማዘጋጀት ላይ ሳሉ፣ በአንድ የሞገድ ርዝመት ብቻ ከማንበብ ይልቅ ለእያንዳንዱ ደረጃ ሙሉውን የሚታይ ብርሃን ክልል፣ ከ550 እስከ 750 nm ገደማ፣ ይቃኙ። ወደ አንድ ሚዛን የተስተካከሉ ስፔክትረሞች ቅርጽ ከክምችት ጋር ከተለወጠ፣ ኬሚስትሪው እየተለወጠ ነው፣ ክልሉም ከመጠን በላይ ሰፊ ነው።
2. በየደረጃው በ610 nm አቅራቢያ ያለውን አብሶርባንስ በ665 nm አቅራቢያ ካለው አብሶርባንስ ጋር ያለውን ሬሾ ይከታተሉ። ከክምችት ጋር የሚጨምር ሬሾ የዳይመሩ ትከሻ-መሰል የስፔክትረም ክፍል እያደገ እና የሞኖመር ሞዴሉ እየከሸፈ መሆኑን ያሳያል። ይህ የምርመራ መንገድ በመሰባሰብ እና የክምችት ተጽዕኖዎች መመሪያ ውስጥ በተጨማሪ ተብራርቷል።
3. በዝቅተኛ ማይክሮሞላር ክምችቶች ለመሥራት የ1 cm ሴል ይጠቀሙ። ተዳፋቱ ወደ 82,000 ሲጠጋ፣ 5 ማይክሮሞላር ወደ 0.41 የሚጠጋ አብሶርባንስ ይሰጣል፣ 10 ማይክሮሞላር ደግሞ 0.82 ገደማ ይሰጣል። ሁለቱም ለአብዛኛዎቹ መሣሪያዎች ምቹ ናቸው።
4. ለከፍተኛ ክምችት ያላቸው መነሻ መፍትሔዎች፣ ከ1 በጣም ከፍ ያለ አብሶርባንስ ከመቀበል ይልቅ የብርሃን መንገዱን ያሳጥሩ። ነገር ግን አጭር መንገድ የብርሃን መለኪያውን እንጂ ኬሚስትሪውን እንደማያስተካክል ያስታውሱ። መሰባሰብ በክምችት ላይ ይመረኮዛል እንጂ በመንገድ ርዝመት ላይ አይደለም። ስለዚህ ከፍተኛ ክምችት ያለው መነሻ መፍትሔ፣ የተሟሟ ሞኖመር ኩርባ ከመጠቀም ይልቅ የራሱን የኬሚካላዊ ቅርጾች ስርጭት ያገናዘበ አቀራረብ ይፈልጋል።

ይህን ገለጻ በአብዛኛው የሚደግፈው አጠቃላይ የሞዴል ማጣጣም፣ ከ1.1 ማይክሮሞላር እስከ 3.4 ሚሊሞላር ያሉ 224 ስፔክትረሞችን አካቶ ነበር። ከ34 ማይክሮሞላር በታችም የቴትራመር ምልክት ቀድሞውኑ መለየት እንደሚቻል አግኝቷል። ይህ ግኝት የሚያሳስበን ጥንቃቄ ነው፦ መስመራዊ ክልሉ በግምት ከሚታሰበው የበለጠ ጠባብ ነው፣ ስለዚህ ከመገመት ይልቅ ያረጋግጡት።

ደረጃዎች፣ ተደጋጋሚ ሙከራዎች እና ቅደም ተከተል

ሦስት ነጥቦች ያሉት ኩርባ ምንም አያረጋግጥም። በICH Q2(R2) ውስጥ ያለው የማረጋገጫ መመሪያ መስመራዊነትን ለመገምገም ቢያንስ አምስት ክምችቶችን ይጠይቃል። ዜሮ ያልሆኑ ከስድስት እስከ ስምንት ደረጃዎች ደግሞ የበለጠ አሳማኝ የሥራ ኩርባ ይሰጣሉ፣ በተለይም መሰባሰብ በሚጀምርበት የላይኛው ጫፍ አቅራቢያ። ደረጃዎቹን የታሰበውን የናሙና ክልል እንዲሸፍኑ ያደራጁ፤ መጣመም የሚጠበቅባቸው ቦታዎች ላይ ተጨማሪ ደረጃዎችን ያቅርቡ። ለምቾት ብቻ የተመረጠ የጂኦሜትሪክ ተከታታይ አይጠቀሙ።

እያንዳንዱን ደረጃ ሁለት ወይም ሦስት ጊዜ ይለኩ፤ ከአንድ ፍላስክ ሦስት ጊዜ ከማንበብ ይልቅ መፍትሔዎቹን ለየብቻ ያዘጋጁ። በተናጠል የተዘጋጁ ተደጋጋሚ ሙከራዎች የዝግጅት ስህተትን ያሳያሉ፤ ከአንድ ፍላስክ የሚደረጉ ተደጋጋሚ ንባቦች ግን የመሣሪያውን ድምፀት ብቻ ያሳያሉ። የ2020 አጠቃላይ ጥናት እያንዳንዱን መፍትሔ ሦስት ጊዜ ለክቷል፤ ይህም አሁንም ጥሩ መነሻ አሠራር ነው። የመለኪያ ንባብ ቅደም ተከተሉን በዘፈቀደ ያደራጁ፣ ስለዚህ የንባብ መንሸራተት፣ በመስታወት ገጽ ላይ መጣበቅ ወይም የሙቀት ለውጥ እንደ ኩርባ መጣመም አይታዩም። በኳርትዝ ኩቬት ላይ የተደረገ ጥናት፣ ከ34 ማይክሮሞላር መፍትሔ ውስጥ የቀለሙ 3 በመቶ ገደማ በ10 ደቂቃዎች ውስጥ በገጹ ላይ እንደሚጣበቅ አግኝቷል። ስለዚህ በሙሉ የመለኪያ ሂደቱ የንክኪ ጊዜን፣ ኩቬቱን፣ የጽዳት አሠራሩን እና ቅደም ተከተሉን ወጥ ያድርጉ።

ለማብራሪያ የተሠራ የስሌት ምሳሌ፣ የተለካ መረጃ አይደለም

ከታች ያሉት ቁጥሮች ስሌቱን ለማሳየት የተፈጠሩ ናቸው። የላቦራቶሪ መለኪያዎች አይደሉም፣ እንደ ሜቲሊን ብሉ መረጃም መጠቀስ የለባቸውም። አስፈላጊው በዙሪያቸው የሚደረጉት ፍተሻዎች አወቃቀር ነው።

ስድስት መደበኛ መፍትሔዎች በተዛመደ ባፈር ውስጥ፣ በ1 cm የብርሃን መንገድ፣ በ665 nm ከተዛመደው ባዶ ማጣቀሻ አንጻር እንደተነበቡ እንገምት፦

አማካይ አብሶርባንስን ከክምችት ጋር በቀጥታ መስመር ማጣጣም፣ በእያንዳንዱ ማይክሮሞላር ወደ 0.0805 የአብሶርባንስ አሃዶች የሚጠጋ ተዳፋት እና ከዜሮ በጥቂት ሚሊአብሶርባንስ አሃዶች ውስጥ ያለ የዘንግ መቆራረጫ ይሰጣል። ተዳፋቱን በብርሃን መንገድ ርዝመቱ መካፈል ወደ ታይቶ የተገኘ የመምጠጥ ብቃት ይቀይረዋል፦ በእያንዳንዱ ማይክሮሞላር 0.0805 ማለት 80,500 M-1 cm-1 ገደማ ነው፣ ይህም በውሃ ውስጥ ሞኖመር ከሚበዛበት ክልል ጋር ይጣጣማል። አስፈላጊው ፍተሻ R ካሬ አይደለም፣ እሱ በሁለቱም ሁኔታዎች እጅግ ጥሩ ይመስላል። አስፈላጊዎቹ ከዜሮ ጋር የተቀራረበው የዘንግ መቆራረጫ፣ ከS2 እስከ S5 ያለው የማይለወጥ A610/A665 ሬሾ እና የተወሰነ አዝማሚያ ሳይኖራቸው የተበታተኑ ቀሪ ልዩነቶች ናቸው። በS6 ያለው የሬሾ ጭማሪ፣ ያንን ደረጃ እንዲያስወግዱ ወይም 7 ማይክሮሞላርን የዚህ ማትሪክስ እና መሣሪያ ጥምረት ጊዜያዊ ከፍተኛ ወሰን አድርገው እንዲመዘግቡ የሚያሳይ እውነተኛ ምልክት ነው።

በተመሳሳይ ሁኔታዎች 0.245 የሚነበብ ያልታወቀ ናሙና በቀጥታ ይቀየራል፦ 0.245ን በእያንዳንዱ ማይክሮሞላር 0.0805 ሲካፈሉ፣ ማንኛውም የናሙና ማሟሟት ማባዣ ከመተግበሩ በፊት 3.0 ማይክሮሞላር ገደማ ይገኛል። ውጤቱን ከሁኔታዎቹ ጋር ያሳውቁ፦ የሞገድ ርዝመት፣ የብርሃን መንገድ፣ የባዶ ማጣቀሻ ማትሪክስ፣ የመለኪያ ማስተካከያ ክልል እና ቀን።

የሚሞላ የመለኪያ ማስተካከያ የሥራ ቅጽ

ለእያንዳንዱ አዲስ ማትሪክስ ይህን አብነት ወደ ላቦራቶሪ መዝገቡ ይቅዱ። አንድ ማትሪክስ፣ አንድ ቅጽ፣ አንድ ኩርባ።

የሬጀንቱ ቅርጽ ረድፍ አስፈላጊ ነው። በንግድ የሚገኝ ሜቲሊን ብሉ ውሃ-አልባ ጨው ወይም እንደ ትራይሃይድሬት ያለ ሃይድሬት ሊሆን ይችላል። የተሳሳተ ሞላር ጅምላም እያንዳንዱን የታሰበ ክምችት ሳይታወቅ ያዛባል። የመነሻ ቁሳቁሱ ንጽህና እና ዝርዝር መስፈርቶች ፍተሻዎች በጥራት እና በደረጃ መመሪያ ውስጥ ተሸፍነዋል።

በተናጠል በተዘጋጀ የፍተሻ መደበኛ መፍትሔ ያረጋግጡ

የመለኪያ ማስተካከያ ኩርባ የራሱን ሥራ ራሱ ፈጽሞ መገምገም የለበትም። መስመሩን ካጣጣሙ በኋላ፣ በተናጠል ከተመዘነ መነሻ መፍትሔ አንድ የፍተሻ መደበኛ መፍትሔ ያዘጋጁ። ክምችቱ ተቀባይነት ያገኘው ክልል መካከል አቅራቢያ ይሁን፣ እንደ ያልታወቀ ናሙናም ያንብቡት። በጥቂት በመቶ ልዩነት ውስጥ መስማማት የዝግጅት ሂደቱን ያረጋግጣል፤ አለመስማማት ግን ከመሣሪያው ይልቅ በመነሻ መፍትሔው ወይም በማሟሟቶቹ ላይ ችግር እንዳለ ያመለክታል። ከእያንዳንዱ የናሙና ስብስብ ጋር የፍተሻ መደበኛ መፍትሔውን ደግመው ይለኩ። ኩርባው ሳይለወጥ የፍተሻው ውጤት ከተንሸራተተ፣ ናሙናዎቹን ከመጠርጠርዎ በፊት የሥራ መፍትሔዎቹን ወይም ኩቬቱን ይጠርጥሩ። ይህ አንድ ልማድ አብዛኛዎቹን በቀላሉ የማይታዩ ስህተቶች ይይዛል፦ በውሃ-አልባ ቁሳቁስ ጠርሙስ ላይ የሃይድሬት ሞላር ጅምላ መጠቀም፣ ማስተካከያው የተዛባ ማይክሮፒፔት፣ በተሳሳተ የአዮን ጥንካሬ የተዘጋጀ ባፈር። በፍተሻው የተመለሰውን መጠን በሥራ ቅጹ ላይ ከተዳፋቱ አጠገብ ይመዝግቡ፣ ስለዚህ በኋላ የሚያነብ ሰው መስመሩ እንደተፈተሸ እንጂ እንዲሁ እንዳልተሳለ ማየት ይችላል።

መስመራዊ አለመሆንን እንደ ችግር መለያ መተርጎም

ኩርባው ሲጣመም፣ የስህተቱ ቅርጽ ምክንያቱን ይለያል። የስፔክትረሙ ቅርጽ ሳይለወጥ በከፍተኛ አብሶርባንስ ላይ ወደ ታች መጣመም፣ ችግሩ በመሣሪያው እንዳለ ያሳያል። ብዙ ጊዜ የሚባክን ብርሃን ከፍተኛ አብሶርባንሶችን ከእውነተኛ መጠናቸው በታች እንዲነበቡ ያደርጋል። በ610 nm ላይ እያደገ ከሚሄድ ትከሻ-መሰል የስፔክትረም ክፍል ጋር የሚታይ መጣመም ደግሞ ኬሚስትሪውን ይጠቁማል፦ ዳይመር እና ከፍተኛ ስብስቦች ብርሃንን ከሞኖመር በተለየ ሁኔታ ይመጥጣሉ። ወደ ዜሮ የማይመጣ ባዶ ማጣቀሻ ወይም ንባባቸው በጊዜ ሂደት የሚቀንስ መደበኛ መፍትሔዎች መያዣውን ይጠቁማሉ፦ በመስታወት ወይም በኩቬቶች ገጽ ላይ መጣበቅ፣ በተለይም በመለኪያ ሂደቱ የንክኪ ጊዜዎች ከተለያዩ። በነጥቦቹ በኩል በትክክል የሚያልፍ መስመር አሁንም የተሳሳቱ የናሙና ውጤቶችን ከሰጠ፣ ማትሪክሱን ይጠቁማል፦ ናሙናዎቹ ከመለኪያ ማስተካከያ መፍትሔዎቹ ይለያያሉ። ስለዚህ ኩርባውን በናሙናው ማትሪክስ ውስጥ እንደገና ይገንቡ ወይም ወደ መደበኛ መጠን የመጨመር ዘዴ ይቀይሩ። በሁሉም ሁኔታ ቀሪ ልዩነቶችን ከክምችት አንጻር በግራፍ ያሳዩ። የዘፈቀደ ስርጭት የቀጥታ መስመር ሞዴሉን ይደግፋል፤ ፈገግታ ወይም ኩርፊያ የሚመስል ቅርጽ ግን ከማንኛውም የR ካሬ ገደብ የበለጠ አስተማማኝ በሆነ መንገድ ሞዴሉን ይቃወማል። የማረጋገጫ መመሪያም ይህን ነጥብ በግልጽ ይደግፋል።

ሜቲሊን ብሉ ይህን ጥንቃቄ በጥሩ ውጤት ይመልሳል። የሞኖመር ባንዱ ጠንካራ ነው፣ ኬሚስትሪው በደንብ ተመርምሯል፣ የስህተት መንገዶቹም ቁጥሮቹን ከማዛባታቸው በፊት በስፔክትረሙ ውስጥ ራሳቸውን ያሳያሉ። ኩርባውን በጠባብ ክልል ይገንቡ፣ ባዶ ማጣቀሻውን በትክክል ያዘጋጁ፣ ተደጋጋሚ ሙከራዎቹን በተናጠል ያዘጋጁ፣ ክልሉንም ለመወሰን የስፔክትረሞቹን ቅርጽ መመሪያ ያድርጉ። የሚገኘው መስመር አጭር ነው፣ ነገር ግን በላዩ ያለ እያንዳንዱ ነጥብ ትክክለኛ ነው።

በዚህ ጽሑፍ ውስጥ ያሉት የማብራሪያ ስሌቶች ዘዴውን ለማሳየት የተፈጠሩ ቁጥሮችን ይጠቀማሉ። የተለኩ የማጣቀሻ ቅንጅቶች ከሙሉ ሁኔታዎቻቸው ጋር በተገናኘው ስፔክትራል ማጣቀሻ ውስጥ ይገኛሉ፣ መሠረት የሆነው የመሰባሰብ ጥናትም በPMID 33251415 ተመዝግቧል።