ሜቲሊን ብሉ በG6PD የላቦራቶሪ ምርመራዎች፦ ቀለሙ በእርግጥ ምን እያደረገ ነው?

አንድ ተማሪ ከኢንኩቤሽን በኋላ ሁለት የሙከራ ቱቦዎችን ይመለከታል። አንዱ የሚጠበቀውን ቀለም ይዟል። ሌላው ግን አልያዘም። ተማሪውም ሁለተኛው ታካሚ የግሉኮስ-6-ፎስፌት ዲሃይድሮጂኔዝ እጥረት አለበት ብሎ ይደመድማል። ይህ ድምዳሜ ትክክል ሊሆን ይችላል፤ ሆኖም የተከተለው አመክንዮ ምርመራው እንዲሠራ የሚያደርገውን ጽንሰ ሐሳብ ዘልሎታል። በቱቦው ውስጥ ኢንዛይሙን በቀጥታ የሚለካ ነገር የለም። የሚለካው ኢንዛይሙ የሚያመነጨው ነገር ሲሆን፣ ሜቲሊን ብሉ እንደ አማካይ ያገለግላል።

ይህ ቀጥተኛ ያልሆነ አሠራር ግልጽ ከሆነ፣ የምርመራው ሂደት፣ የመቆጣጠሪያ ናሙናዎቹ እና ረጅሙ የሐሰተኛ ውጤቶች ዝርዝር ሁሉ ያለምክንያት የተቀመጡ አይመስሉም።

አጭሩ መልስ

ሜቲሊን ብሉ በG6PD ምርመራ ውስጥ የሬዶክስ አመልካች ነው። የG6PD ኢንዛይም NADPH ያመነጫል፤ በNADPH ላይ የሚመረኮዙ ሥርዓቶችም ሰማያዊውን ሜቲሊን ብሉ በሪዳክሽን ወደ ቀለም አልባው የሉኮ ቅርጽ ይቀይሩታል፣ ወይም ኤሌክትሮኖችን ለማዘዋወር ይጠቀሙበታል። መደበኛ የኢንዛይም እንቅስቃሴ ቀልጣፋ ሪዳክሽን ያስገኛል። ዝቅተኛ እንቅስቃሴ ግን ዘገምተኛ ወይም ያልተሟላ ሪዳክሽን ያስገኛል። የምርመራው ምልክት ይህ ብቻ ነው።

ሁለት ታሪካዊ ዘዴዎች ተመሳሳይ ቀለም ቢጠቀሙም፣ ውጤታቸውን የሚያሳየው የመጨረሻ ምልክት ይለያያል። ሁለቱን ለይቶ መረዳት አብዛኛውን ግራ መጋባት ያስወግዳል።

ሁለት ምርመራዎች፣ አንድ ቀለም፣ የተለያዩ የመጨረሻ ምልክቶች

የመጀመሪያው በሳስ እና ባልደረቦቹ የተገለጸው፣ በኋላም በጊብስ የተገመገመው ቀጥተኛ የሜቲሊን ብሉ ሪዳክሽን ምርመራ ነው። እዚህ የመጨረሻው ምልክት ቀለሙ ራሱ ነው፤ ኦክሲዴሽን የተደረገበት ሰማያዊ ሜቲሊን ብሉ በሪዳክሽን ወደ ቀለም አልባ ሉኮሜቲሊን ብሉ ይቀየራል። የዚህ ለውጥ ፍጥነትም NADPH የማመንጨት አቅምን ያንጸባርቃል። የመጀመሪያው የማጣሪያ ምርመራ ጽሑፍ በPubMed ላይ በሳስ እና ሌሎች (1966) ስም ተመዝግቧል።

ሁለተኛው የብሪወር ሜትሄሞግሎቢን ሪዳክሽን ምርመራ ነው። መጀመሪያ ሶዲየም ናይትራይት ሄሞግሎቢንን በኦክሲዴሽን ወደ ቡናማ ሜትሄሞግሎቢን ይቀይረዋል። ከዚያ ሜቲሊን ብሉ የኤሌክትሮን ዝውውር አማካይ ሆኖ ይሠራል፤ ሪዳክሽን የተደረገበት ሜቲሊን ብሉ የሪዳክሽን እኩል አቅም ያላቸውን ኤሌክትሮኖች ለሜትሄሞግሎቢን በማስተላለፍ መልሶ ወደ ቀይ ሄሞግሎቢን ይቀይረዋል። ስለዚህ በዓይን የሚታየው የመጨረሻ ምልክት ቡናማ ወይም ቀይ እንጂ ሰማያዊ ወይም ቀለም አልባ አይደለም። የመጀመሪያው ዘዴ በዓለም ጤና ድርጅት ቡለቲን (ብሪወር እና ሌሎች፣ 1960) ታትሟል።

የብሪወር ምርመራን ቀለም የማጥፋት ምርመራ ብሎ መጥራት ከኬሚስትሪ አንጻር ትክክለኛ አይደለም። ቀለሙ በኦክሲዴሽንና በሪዳክሽን መካከል ይመላለሳል፤ ቀለሙን የሚቀይረው ግን ሄሞግሎቢን ነው። ከታች ያለው ሥዕላዊ መግለጫ ሁለቱንም መንገዶች ያሳያል።

መሠረታዊው ምላሽ

G6PD የፔንቶስ ፎስፌት መንገድን የመጀመሪያ ኦክሲዴሽን ደረጃ ያፋጥናል፦

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

በBlood ውስጥ በሉዛቶ እና ባልደረቦቹ (2020) እንደተብራራው፣ የበሰሉ ቀይ የደም ሕዋሳት NADPH ለማግኘት በዚህ መንገድ ላይ በእጅጉ ይመረኮዛሉ። NADPH ግሉታታዮንን ሪዳክሽን በተደረገበት ቅርጽ ያቆያል፤ ሕዋሱንም ከኦክሲዴሽን ጉዳት ይጠብቃል። ሜቲሊን ብሉ ኤሌክትሮን ተቀባይ ሆኖ በዚህ ሥርዓት ውስጥ ይሳተፋል። በቂ G6PD በቂ NADPH ያስገኛል፤ ይህም ቀልጣፋ ሪዳክሽን ያስገኛል። ዝቅተኛ G6PD ይህን ሰንሰለት በመጀመሪያው ማያያዣ ላይ ያቋርጠዋል።

ቀለሙን እንደ ነዳጅ መለኪያ ያስቡት፣ እንደ ሞተር አይደለም። የNADPH አቅርቦትን ያሳያል። ይህን አቅርቦት ወይም የውጤት ንባቡን የሚቀይር ሌላ ማንኛውም ነገር፣ በጂኑ ላይ ምንም ለውጥ ሳይኖር፣ መለኪያውን ሊያንቀሳቅስ ይችላል።

የብሪወር ዓይነት ምርመራ እንዴት ይካሄዳል?

የሪኤጀንት ዝግጅት ቀመሮች ባለፉት አሥርተ ዓመታት ተለዋውጠዋል፤ ስለዚህ ለማስተማር የቀረበ ገለጻ እንደ ክሊኒካዊ የሥራ መመሪያ መወሰድ የለበትም። እያንዳንዱ ላቦራቶሪ የራሱን ተረጋግጦ የጸደቀ መደበኛ የሥራ ሂደት ይከተላል። ይህን ማስጠንቀቂያ በማስታወስ፣ ባህላዊው የቱቦ ምርመራ በሚከተለው መንገድ ይሠራል፤ በዚህ የታተመ አተገባበር ሦስት ቱቦዎችና የ3 ሰዓት ኢንኩቤሽን ተጠቅመው ተገልጿል፦

1. የታካሚው ቱቦ፦ ሙሉ ደም፣ ግሉኮስ፣ ሶዲየም ናይትራይት እና ሜቲሊን ብሉ። ናይትራይት ሜትሄሞግሎቢን ይፈጥራል፣ ግሉኮስ የቀይ የደም ሕዋሳትን ሜታቦሊዝም ይደግፋል፣ ቀለሙም በNADPH ላይ የተመረኮዘ የኤሌክትሮን ዝውውር ያስችላል።
2. ኦክሲዴሽን የተደረገበት መቆጣጠሪያ፦ ደም፣ ናይትራይት እና ግሉኮስ፣ ግን ሜቲሊን ብሉ የለበትም። የእጥረት ንድፍ የሆነውን ቡናማ የሜትሄሞግሎቢን የመጨረሻ ምልክት ያሳያል።
3. የሄሞግሎቢን መቆጣጠሪያ፦ ደም እና ውሃ። መደበኛውን ንድፍ የሚወክለውን ቀይ የሄሞግሎቢን የመጨረሻ ምልክት ያሳያል።
4. ሁሉንም ቱቦዎች ወደ 37 C በሚጠጋ ሙቀት፣ በተለምዶ ለ3 ሰዓታት፣ በእርጋታ እያቀላቀሉ በኢንኩቤሽን ያቆዩ።
5. ሕዋሳቱን ለማፍረስና የቀለም ንጽጽሩን ግልጽ ለማድረግ፣ ከእያንዳንዱ ቱቦ ትንሽ መጠን ወስደው በተጣራ ውሃ ይበርዙ።
6. የታካሚውን ቱቦ ከሁለቱ መቆጣጠሪያዎች ጋር ያወዳድሩ። ወደ ቀይ መመለስ ከፍተኛ የሪዳክሽን አቅም መኖሩን ያሳያል። ቡናማነቱ መቀጠል ደግሞ ጉልህ እጥረት እንዳለ ይጠቁማል።

አንድ ታሪካዊ ቀመር ወደ 1 mL የሚጠጋ ደም፣ ከ180 mM ሶዲየም ናይትራይት፣ 280 mM ዴክስትሮስ እና 0.4 mM ሜቲሊን ብሉ ጋር በሚቀራረቡ ሪኤጀንቶች ተጠቅሟል። እነዚህን ቁጥሮች ከጽሑፎች የተወሰዱ ምሳሌዎች እንጂ ሁሉንም የሚመለከት መስፈርት እንደሆኑ አይውሰዷቸው።

ውጤቱን ማንበብ

በዚህ የMalaria Journal የG6PD ማወቂያ ክፍተቶች ግምገማ እንደተብራራው፣ ጥራታዊ ማጣሪያ ምርመራ በተሻለ ሁኔታ የሚለየው ከመደበኛው እንቅስቃሴ 30 እስከ 40 በመቶ አካባቢ ነው። ስለዚህ መደበኛ የማጣሪያ ውጤት ማለት ምርመራው ከፍተኛ እጥረት አላገኘም ማለት ነው። እንቅስቃሴው ሙሉ በሙሉ መደበኛ መሆኑን አያረጋግጥም።

ማጣሪያ ምርመራ ለምን ሊያሳስት ይችላል?

ከሄሞሊሲስ በኋላ የሚከሰት የሬቲኩሎሳይቶች መብዛት በተለምዶ የሚታወቀውን ሐሰተኛ መደበኛ ውጤት ያስከትላል። ወጣት ቀይ የደም ሕዋሳትና ሬቲኩሎሳይቶች ከአሮጌ ሕዋሳት የበለጠ G6PD አላቸው። በአጣዳፊ የሄሞሊሲስ ክስተት ወቅት፣ እጅግ ያረጁና ከፍተኛ እጥረት ያለባቸው ሕዋሳት አስቀድመው ሊጠፉ ይችላሉ። በዚህም እንቅስቃሴያቸው በምርመራ መደበኛ የሚመስል ወጣት ሕዋሳት ይቀራሉ። ይህ ተመሳሳይ ባዮሎጂያዊ ሁኔታ የቀለም ማጣሪያዎችን ብቻ ሳይሆን መጠናዊ ምርመራዎችንም ያሳስታል።

በቅርብ ጊዜ የተደረገ ደም መውሰድ እጥረትን ይሸፍናል፤ ምክንያቱም የለጋሹ ቀይ የደም ሕዋሳት የራሳቸውን ኢንዛይም ወደ ናሙናው ይጨምራሉ። Mayo Clinic Laboratories ደም መውሰድን፣ ከሬቲኩሎሳይቶች መብዛትና ከነጭ የደም ሕዋሳት ጣልቃ ገብነት ጋር፣ የኢንዛይም ውጤቶች አስተማማኝ እንዳይሆኑ ከሚያደርጉ ምክንያቶች መካከል ይዘረዝራል።

ሄትሮዚጎት ሴቶች እጅግ አስቸጋሪው ሁኔታ ናቸው። የX-ክሮሞሶም በዘፈቀደ እንቅስቃሴ ማጣት መደበኛና እጥረት ያለባቸው ቀይ የደም ሕዋሳት ድብልቅ ይፈጥራል። አጠቃላይ እንቅስቃሴውም ከከፍተኛ እጥረት እስከ መደበኛ እስከሚመስል ድረስ በማንኛውም ደረጃ ሊሆን ይችላል። ጥራታዊ ማጣሪያዎች መካከለኛ ፊኖታይፖችን በተደጋጋሚ ሳያውቁ ያልፋሉ። የWHO የG6PD ምርመራ ሰነድ ይህን ውስንነት በዝርዝር ያብራራል።

ናሙናው ከተወሰደ በኋላ ያለፈው ጊዜ፣ የማከማቻ ሙቀት፣ በዓይን የሚታየውን የመጨረሻ ምልክት መገምገም በተመልካቹ ላይ መመርኮዙ፣ ሄማቶክሪት እና የሪኤጀንት ጥራት፣ ከእነዚህ ባዮሎጂያዊ ተጽእኖዎች በተጨማሪ በትንተናው ላይ ተጨማሪ መዛባት ይፈጥራሉ።

ማጣሪያ ምርመራ የመጨረሻ ምርመራ አይደለም

እጥረትን የሚያሳይ፣ መካከለኛ የሆነ ወይም ከክሊኒካዊ ሁኔታው ጋር የማይስማማ የማጣሪያ ውጤት፣ መጠናዊ የG6PD ኢንዛይም ምርመራ ይፈልጋል። WHO ሙቀቱ የሚቆጣጠርበትን መጠናዊ ስፔክትሮፎቶሜትሪ እንደ ማጣቀሻ ዘዴ ይቆጥረዋል። በዚህ ምርመራ፣ የቀይ የደም ሕዋሳት ከፈረሱ በኋላ በተገኘው ፈሳሽ ላይ ግሉኮስ-6-ፎስፌት እና NADP+ ይጨመራሉ። የሚፈጠረው NADPH በ340 nm ላይ የብርሃን መምጠጡ እየጨመረ በመሄዱ ይከታተላል። የለውጡ ፍጥነት ከኢንዛይም እንቅስቃሴ ጋር ተመጣጣኝ ነው፤ በተለምዶም በአንድ ግራም ሄሞግሎቢን ያለ ዩኒት ሆኖ ይሰላል። ወቅታዊው የክሊኒካዊ ላቦራቶሪ አሠራር በMayo የምርመራ ካታሎግ የG6PD እንቅስቃሴ መዝገብ ተጠቃሏል።

የውጤት ትርጓሜ በላቦራቶሪው የተረጋገጠውን የማጣቀሻ ክልል ይጠቀማል። ይህም ብዙውን ጊዜ ከሕዝቡ መደበኛ እንቅስቃሴ አንጻር ይገለጻል፤ እጥረት በተለምዶ በ30 በመቶ ወሰን አካባቢ፣ መካከለኛ እንቅስቃሴ ደግሞ ከዚያ በላይ ይወያይበታል። የWHO ለG6PD ምርመራዎች የዒላማ ምርት መገለጫዎች (2022) ይህን የምርመራ ማዕቀፍ ያቀርባሉ። በቅርብ ጊዜ የተከሰተ ሄሞሊሲስ ወይም ደም መውሰድ ፊኖታይፕን መወሰን አስተማማኝ እንዳይሆን ካደረገ፣ የቀይ የደም ሕዋሳት ስብስብ ወደ ሚዛኑ ከተመለሰ በኋላ ምርመራውን ይድገሙ። ሞለኪውላዊ ምርመራም የኢንዛይም መለኪያውን ሳይተካ ተጨማሪ መረጃ ሊሰጥ ይችላል።

ሊጠበቅ የሚገባው ወሰን

በእነዚህ ምርመራዎች ውስጥ ሜቲሊን ብሉ ከሰውነት ውጭ በተወሰደ ናሙና ላይ የሚያገለግል የላቦራቶሪ ሪኤጀንት ነው። ይህ እውነታ፣ ሜቲሊን ብሉን ለታካሚ ከመስጠት ደህንነት ጋር ከተያያዘው ውይይት የተለየ ነው፤ ያ ጉዳይ ሜቲሊን ብሉ መጠቀም በማይገባባቸው ሁኔታዎች ላይ ባለው መመሪያ ተዳሷል። መድኃኒቱም በNADPH ላይ በተመረኮዘ ሪዳክሽን የሚመረኮዝ ስለሆነ፣ ባዮኬሚስትሪው ሁለቱን ያገናኛቸዋል። ሆኖም በሙከራ ቱቦ ውስጥ ያለ ቀለም፣ በደም ዝውውር ውስጥ ያለ የመድኃኒት መጠን አይደለም። ቀለሙ በሌላ ሁኔታ ለማቅለም ሲጠቀም እንዴት እንደሚሠራ ለመረዳት፣ የሜቲሊን ብሉ የማቅለም መርሆችን ይመልከቱ፤ የሚካተትበትን የኬሚካል ቤተሰብ ለማወቅ ደግሞ በላቦራቶሪ ውስጥ ስለሚጠቀሙባቸው የሬዶክስ ቀለሞች ይመልከቱ።

ማጣሪያ ምርመራ የሪዳክሽን አቅም ያልተዳከመ ይመስላል ወይ ብሎ ይጠይቃል። የማረጋገጫ ምርመራ ደግሞ በእርግጥ ምን ያህል ኢንዛይም አለ ብሎ ይጠይቃል። ማንም ሁለተኛውን ጥያቄ እንዲመልስ እስካልጠየቀው ድረስ፣ ቀለሙ የመጀመሪያውን ጥያቄ በሚገባ ያገለግላል።