በEMB አጋር ላይ የE. coli እና የሌሎች ኮሎኒዎችን ገጽታ መተርጎም

አንድ ተማሪ ያልታወቀ ናሙናን በኢዮሲን ሜቲሊን ሰማያዊ አጋር ላይ በመስመር ይዘራል፣ ሌሊቱን ሙሉ በማሳደጊያ ሙቀት ያቆየዋል፣ ከዚያም አረንጓዴ ብልጭታ ያላቸውን ጥቁር ኮሎኒዎች በሳህኑ ላይ ያገኛል። በማስታወሻ ደብተሩ ውስጥ “E. coli፣ ተረጋግጧል” ብሎ ይጽፋል። ይህ ማስታወሻ ሳህኑ ሊደግፈው ከሚችለው በላይ የሆነ መደምደሚያ ይሰጣል። ሳህኑ በተወሰኑ ሁኔታዎች የሚታዩ የእድገትና የፍላት ባህሪያትን ያሳያል። የዝርያ ማንነት ግን የተለየ ማስረጃ የሚያስፈልገው የተለየ መደምደሚያ ነው።

ይህ መመሪያ የEMB አጋር ውጤቶችን እንደ ትርጓሜ ሥራ ይመለከታል። መሠረታዊ ሐሳቡን ያብራራል፣ የቁጥጥር ናሙናዎችን ያካተተ ምስላዊ የሳህን መመሪያ ያቀርባል፣ እንዲሁም የመማሪያ መጽሐፍ ገጽታ ሊያሳስት የሚችልባቸውን ሁኔታዎች ይጠቅሳል።

ከሳህኑ ጀርባ ያለው ሐሳብ

EMB አጋር መራጭም መለያም ማሳደጊያ ነው። ኢዮሲን Y እና ሜቲሊን ሰማያዊ ቀለሞች የብዙ ግራም አዎንታዊ ፍጡራንን እድገት ይገታሉ፤ ስለዚህ ማሳደጊያው ለግራም አሉታዊ ፍጡራን እድገት ይመቻል። እነዚሁ ቀለሞች እንደ አመልካቾችም ይሠራሉ፦ አንድ ፍጡር የሚገኘውን ስኳር በፍላት ሲያፈርስ እና በአካባቢው በቂ አሲድ ሲያመነጭ፣ ኮሎኒው ብዙ ቀለም በመውሰድ ከጥቁር ሐምራዊ እስከ ሰማያዊ ጥቁር ይሆናል። አሲድ በከፍተኛ መጠን ሲመረት፣ የኮሎኒው ወለል እንደ እይታ አቅጣጫው የሚለዋወጥ ብረታዊ አረንጓዴ ነጸብራቅ ሊያሳይ ይችላል። የASM የኢዮሲን ሜቲሊን ሰማያዊ አጋር ሳህኖች የአሠራር መመሪያ ይህን የመምረጥና የመለየት ጥምረት ያብራራል፣ ለማስተማርም የማጣቀሻ ፎቶግራፎችን ያቀርባል።

ማንኛውንም ውጤት ከመተርጎምዎ በፊት አንድ ዝርዝር ጠቃሚ ነው፦ የትኛው የማሳደጊያ አዘገጃጀት ጥቅም ላይ እንደዋለ ያረጋግጡ። የቀድሞው Holt Harris Teague አዘገጃጀት ላክቶስና ሱክሮስ ይዟል፤ Levine EMB ግን ላክቶስ ብቻ ይዟል። እንደ ብዙ Serratia marcescens ተለይተው የተወሰዱ ናሙናዎች ሱክሮስን በፍላት የሚያፈርስ ነገር ግን ላክቶስን የማያፈርስ ፍጡር በሁለቱ አዘገጃጀቶች ላይ የተለየ ገጽታ ሊኖረው ይችላል። የEMB ማሳደጊያዎች የአምራች ሰነድ ይህን የአዘገጃጀት ልዩነት በግልጽ ይገልጻል። ከውጤቱ ጋር የአምራቹን ስምና የማሳደጊያውን አዘገጃጀት በማስታወሻ ደብተሩ ውስጥ ይመዝግቡ።

የተዘጋጀ ነገር ግን ናሙና ያልተዘራበት EMB አጋር በአብዛኛው ከቀይ ቡናማ እስከ ቀይ ሐምራዊ ቀለም አለው፤ አንዳንድ ጊዜም አረንጓዴ የሚመስል ቅላጼ ወይም ጥቃቅን ዝቃጭ ይኖረዋል። ይህ የጀርባ ቀለም እድገት አይደለም። እያንዳንዱን ምልከታ ናሙና ካልተዘራበት ሳህን ወይም ከተመዘገበው መነሻ ገጽታ ጋር ያነጻጽሩ። የማስተማሪያ አሠራር መመሪያው በሌላ መንገድ ካልገለጸ በስተቀር፣ የመጀመሪያውን ሳህን በ35 እስከ 37 C ኦክስጅን ባለበት ሁኔታ ለ18 እስከ 24 ሰዓታት ካቆዩት በኋላ ይመልከቱ። ረዘም ያለ የማሳደጊያ ጊዜ የፍላት ገጽታን ሊለውጥ ይችላል።

ሳህኑን እንዴት መመልከት እንደሚገባ

ሁለት የብርሃን ዓይነቶችን ይጠቀሙ። መጀመሪያ ሳህኑን በተንጸባረቀ ወይም በሰያፍ ከሚወድቅ ብርሃን ሥር ይመልከቱና ያዘንብሉት፦ ብረታዊው ነጸብራቅ እንደ እይታ አቅጣጫው ስለሚለዋወጥ፣ ከአንድ አቅጣጫ ሊታይ ከሌላው ደግሞ ሊጠፋ ይችላል። ከዚያም የኮሎኒውን ቀለምና ጥቁር መሃል ለመገምገም በሳህኑ ውስጥ በሚያልፍ ብርሃን ይመርምሩት። መጨናነቅና አጎራባች ኮሎኒዎች በአካባቢው የሚከማቸውን አሲድ ስለሚቀይሩ፣ ቀለሙን ሊያዳክሙ ወይም ከልክ በላይ ሊያጎሉ ይችላሉ፤ ስለዚህ በደንብ ከተለዩ ኮሎኒዎች ይጀምሩ። የASM ምስሎች ስብስብ ይህን በቀጥታ ያሳያል፦ በተቀላቀለ ባህል ውስጥ ያለ E. coli፣ በዙሪያው ያሉ ፍጡራን የአሲድ አካባቢውን ስለሚቀይሩ፣ የሚጠበቀውን ነጸብራቅ ሊያጣ ይችላል።

ልምምዱ በፈቀደ ቁጥር የቁጥጥር ናሙናዎችን ያካትቱ። በEMB ማሳደጊያዎች መደበኛ የጥራት ቁጥጥር ሰንጠረዦች እንደተዘረዘሩት፣ በተለምዶ ለማስተማር የሚጠቀሙበት ስብስብ ለሰማያዊ ጥቁር ቀለምና ለብረታዊ ነጸብራቅ ባህሪ E. coli ATCC 25922፣ ለቀለም አልባ ባህሪ እንደ Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ወይም Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ያለ ፍላት የማያካሂድ ፍጡር፣ እና ለእድገት መገታት ቁጥጥር እንደ Enterococcus faecalis ወይም Staphylococcus aureus ያለ ግራም አዎንታዊ ፍጡር ነው። አዎንታዊው የቁጥጥር ናሙና ነጸብራቅ ከሌለው፣ ያልታወቀውን ናሙና ከመጠርጠርዎ በፊት የማሳደጊያ ሁኔታውን፣ መጨናነቁን ወይም አዘገጃጀቱን ይጠርጥሩ።

ምስላዊ የሳህኖች መመሪያ

ከዚህ በታች ያሉት ሳህኖች የተፈጠሩ መግለጫ ምስሎች እንጂ የእውነተኛ ባህሎች ፎቶግራፎች አይደሉም። መፈለግ ያለብዎትን አጠቃላይ ገጽታ ያሳያሉ እንጂ የአንድን የዝርያ መስመር ትክክለኛ የቀለም ጥላ አያሳዩም። ከASM የማጣቀሻ ፎቶግራፎች እና በማስተማሪያ ላቦራቶሪው ካሉ እውነተኛ ሳህኖች ጋር ያነጻጽሯቸው።

ሳህን 1፦ በEMB አጋር ላይ Escherichia coli፣ ላክቶስን በከፍተኛ መጠን በፍላት የሚያፈርስ ፍጡር

በEMB አጋር ላይ E. coli በአብዛኛው ከጥቁር ሐምራዊ እስከ ሰማያዊ ጥቁር ቀለም ይኖረዋል፤ ብዙ ጊዜም ጥቁር መሃል እና በከፍተኛ የአሲድ ምርት ምክንያት ብረታዊ አረንጓዴ ነጸብራቅ ይታይበታል። ይህ ነጸብራቅ ተማሪዎች የሚፈልጉት ታዋቂ ምልክት ቢሆንም፣ እንደ ደጋፊ ማስረጃ እንጂ እንደ መለያ ትርጉም አይውሰዱት። የነጸብራቁ ጥንካሬ እንደ የዝርያ መስመሩ፣ የማሳደጊያ ጊዜው፣ የኮሎኒዎቹ ጥግግት እና የእይታ አቅጣጫው ይለያያል። ነጸብራቅ አለመኖሩ E. coli እንደሌለ አያስወስንም፤ ነጸብራቅ የሌለው ጥቁር ኮሎኒም ወደ ሌሎች በርካታ ፍላት የሚያካሂዱ ፍጡራን ሊያመለክት ይችላል። ለማንኛውም ቀጣይ ሥራ ከተጨናነቀ ክፍል ገጽታ ከመነሳት ይልቅ በደንብ የተለየ ኮሎኒ ይምረጡ።

ሳህን 2፦ በEMB አጋር ላይ Klebsiella pneumoniae፣ ሙከስ መሰል ፍላት የሚያካሂድ ፍጡር

በEMB አጋር ላይ Klebsiella pneumoniae በአብዛኛው ከሮዝ ሐምራዊ እስከ ቡናማ ሐምራዊ የቀለም ጥላዎች ያላቸው፣ ትልልቅ፣ የሚያብረቀርቁ፣ ሙከስ መሰል ኮሎኒዎችን ይፈጥራል። ብዙ ጊዜ ጥቁር መሃል አላቸው፣ ግን በአብዛኛው ጠንካራ ብረታዊ ነጸብራቅ አይኖራቸውም። እንደ Enterobacter ያሉ ተዛማጅ ፍላት የሚያካሂዱ ፍጡራንም ተመሳሳይ ቅርጽ ሊያሳዩ ይችላሉ። ሙከስ መሰል ይዘትና የኮሎኒው መጠን የትርጓሜው አካል ናቸው፦ ትንሽና ጠፍጣፋ ሮዝ ኮሎኒ ከትልቅ፣ ጉብታ መሰል፣ ሙከስ መሰል ኮሎኒ የተለየ የማስረጃ ክብደት አለው። እንደ E. coli ሁሉ፣ ሳህኑ የፍላት ባህሪን ይጠቁማል፤ በዝርያ ደረጃ ስም ለመስጠት ግን ከታች የተገለጸው ባዮኬሚካላዊ ማረጋገጥ ያስፈልጋል።

ሳህን 3፦ በEMB አጋር ላይ Salmonella እና ሌሎች ፍላት የማያካሂዱ ፍጡራን፣ ቀለም አልባ ኮሎኒዎች

በEMB አጋር ላይ Salmonella እና ተዛማጅ ላክቶስን በፍላት የማያፈርሱ ፍጡራን፣ Shigella እና ብዙ ተለይተው የተወሰዱ Pseudomonas ናሙናዎችን ጨምሮ፣ በአብዛኛው ቀለም አልባ፣ ብርሃን በከፊል የሚያሳልፉ ወይም ፈዛዛ አምበር ቀለም ያላቸው ኮሎኒዎች ሆነው ያድጋሉ። አንዳንድ አዘገጃጀቶችና ሁኔታዎች ደካማ ሮዝ ቅላጼ ሊሰጡ ስለሚችሉ፣ ፈዛዛ ሮዝ ኮሎኒ በቀጥታ ፍላት የሚያካሂድ ፍጡር ነው ማለት አይደለም። EMB፣ Salmonellaን ከShigella ወይም ከሌሎች ፍላት የማያካሂዱ ፍጡራን አይለይም፤ ይህ ልዩነት በቀጣይ ምርመራዎች ይወሰናል። እንዲሁም ላክቶስን በፍላት የሚያፈርሱ፣ እንደ E. coli ያሉ ብረታዊ ኮሎኒዎችን የሚፈጥሩ የSalmonella የዝርያ መስመሮች እንደተመዘገቡ ልብ ይበሉ። ይህም አንድ ሳህን ብቻ ጉዳዩን ሊያስወስን የማይችልበት ተጨማሪ ምክንያት ነው።

ሳህን 4፦ Serratia marcescens እና የአዘገጃጀት ወጥመድ

Serratia marcescens የራሱን ክፍል የሚያስፈልገው፣ ተማሪዎች ብዙ ጊዜ ቀይ ኮሎኒዎችን በመጠበቅ ሳህኑን በስህተት ስለሚተረጉሙ ነው። ከክሊኒካዊ ናሙናዎች ተለይተው የተወሰዱት አብዛኞቹ ላክቶስን በፍላት አያፈርሱም፤ ስለዚህ በLevine EMB ላይ ብዙ ጊዜ ፈዛዛ ወይም ደካማ ቀለም ያላቸው ሆነው ይታያሉ። ብዙዎቹ ሱክሮስን በፍላት ስለሚያፈርሱ፣ ሱክሮስ ያለበት አዘገጃጀት ጠቆር ያለ ወይም ከአሲድ ጋር ይበልጥ የተያያዘ ምላሽ ሊያሳይ ይችላል። በ35 እስከ 37 C የታወቀውን ቀይ ፕሮዲጂዮሲን ቀለምም አይጠብቁ፤ በማሳደጊያ መሣሪያው ሙቀት የዚህ ቀለም ምርት አስተማማኝ አይደለም። የአሠራር መመሪያው Serratia marcescensን በEMB አጋር ላይ ሲጠቅስ፣ መግለጫው የትኛውን አዘገጃጀት እንደሚገምት ያረጋግጡ። የSerratia ሜታቦሊዝም ግምገማ ከዚህ ወጥመድ ጀርባ ያለውን፣ ላክቶስን አለማፍረስና ሱክሮስን የማፍረስ ተለዋዋጭነት ያጠቃልላል።

ሳህን 5፦ የቁጥጥር ናሙናዎች እና እድገታቸው የተገታ ፍጡራን

እንደ Staphylococcus፣ Enterococcus፣ Streptococcus እና Bacillus ያሉ ግራም አዎንታዊ ፍጡራን በአጠቃላይ በEMB አጋር ላይ እድገታቸው ይገታል ወይም በእጅጉ ይቀንሳል፤ ነገር ግን ይህ መገታት ለእያንዳንዱ የዝርያ መስመር ፍጹም አይደለም። የቁጥጥር ናሙናዎች ስብስብ ትርጓሜው በማስረጃ ላይ እንዲመሠረት ያደርጋል፦ የE. coli ቁጥጥር ናሙና በሰማያዊ ጥቁር ቀለምና በነጸብራቅ ጥሩ እድገት ማሳየት አለበት፣ ፍላት የማያካሂደው የቁጥጥር ናሙና ቀለም አልባ እድገት ማሳየት አለበት፣ የእድገት መገታት ቁጥጥር ናሙናው ደግሞ እጅግ አነስተኛ እድገት ወይም ምንም እድገት ማሳየት የለበትም። የእድገት መገታት ቁጥጥር ናሙናው በደንብ ካደገ፣ የመምረጥ ደረጃው አልተሳካም፣ እና በዚያ የማሳደጊያ እጣ ላይ ያሉ ሌሎች ትርጓሜዎች ሁሉ አጠራጣሪ ናቸው። የማቅለሚያ ዘዴዎች ከማሳደጊያ ሚዲያዎች የተለየ ጥያቄ ይመልሳሉ፤ ለላቦራቶሪው የስላይድ ማቅለሚያ ክፍል፣ የሜቲሊን ሰማያዊ ማቅለሚያ ምስላዊ መመሪያን ይመልከቱ።

ገደቡን ያወቀ ንጽጽር

ሦስት ዓረፍተ ነገሮች አሳሳች ገጽታዎቹን ያጠቃልላሉ። ጥቁር መሆን E. coli መሆን አይደለም፤ Klebsiella፣ Enterobacter እና ሌሎች ፍላት የሚያካሂዱ ፍጡራን ያለ ነጸብራቅ ጥቁር መሃል ስለሚፈጥሩ። ሮዝ መሆን Klebsiella መሆን አይደለም፤ መጠነኛ ወይም ዝግ ያለ ፍላት የሚያካሂዱ ፍጡራን እና አንዳንድ ፍላት አያካሂዱም ተብለው የሚመደቡ ፍጡራን ሮዝ ወይም ፈዛዛ ሐምራዊ ሆነው ስለሚታዩ። ነጸብራቅ መኖር E. coli በእርግጠኝነት መሆን አይደለም፤ ሌሎች ከፍተኛ ፍላት የሚያካሂዱ ፍጡራንም ሊያመነጩት ስለሚችሉ። የማስተማሪያ አሠራር መመሪያውና የተቀላቀሉ ባህሎች ምስሎቹ እያንዳንዱን የእነዚህ ግምቶች ድክመት ያሳያሉ።

የማረጋገጥ ገደቦች

EMB አጋር የሚያሳየው የሚገለጥ ባህሪ እንጂ ዝርያ አይደለም። የተለያዩ ፍጡራን አንድ ዓይነት የኮሎኒ ገጽታ ሊጋሩ ይችላሉ፣ እና አንድ ፍጡር እንደ የዝርያ መስመሩ፣ ዕድሜው፣ መጨናነቁ፣ አዘገጃጀቱ እና የማሳደጊያ ሁኔታው ከመማሪያ መጽሐፉ ገጽታ ሊለይ ይችላል። ለዚህ ነው የማስተማሪያና የክሊኒካዊ የሥራ ሂደቶች የEMB ቅርጽን እንደ ቅድመ ግምት የሚወስዱት።

በማስረጃ ሊደገፍ የሚችል የተማሪ የሥራ ሂደት ይህ ነው፦ የተለየውን ኮሎኒ ይግለጹ፣ ማለትም መጠኑን፣ ቀለሙን፣ መሃሉን፣ በሰያፍ ብርሃን የሚታየውን ነጸብራቅ እና ሙከስ መሰል ባህሪውን፤ አዘገጃጀቱን፣ የማሳደጊያ ጊዜና ሙቀትን፣ እና የቁጥጥር ናሙናዎቹን ይመዝግቡ፤ ከዚያም ማንኛውንም ማረጋገጫ ምርመራ ከማድረግዎ በፊት በደንብ የተለየ ኮሎኒን ዳግም በማሳደግ ንጹሕ ባህል ያግኙ። የተለመዱ ቀጣይ ምርመራዎች ለE. coli እና ለኮሊፎርም ቅድመ ለየታ የግራም ማቅለሚያና የIMViC ምላሾችን፣ ለአንጀት ፍጡራን TSI ወይም KIA እና ለፍጡሩ የተለዩ የባዮኬሚካል ምርመራ ስብስቦችን ያካትታሉ። ሥራው ሲጠይቅም ሴሮሎጂያዊ፣ MALDI TOF ወይም ሌላ ትክክለኛነቱ የተረጋገጠ የለየታ ዘዴ ይጠቀማሉ። EMB በመራጭና በመለያ የአንጀት ማሳደጊያ ሚዲያዎች መካከል እንዴት እንደሚካተት ለማወቅ፣ ስለ አንጀት ፍጡራን ማሳደጊያ ሚዲያዎች መግቢያ ጽሑፎችን እና የግራም ማቅለሚያ ቀጣይ ምርመራን ይመልከቱ። ሰማያዊ የስላይድ ማቅለሚያ ምን ሊያረጋግጥ እንደሚችልና እንደማይችል ለሚመለከተው ተዛማጅ ጥያቄ፣ የሜቲሊን ሰማያዊ ማቅለሚያ ምስላዊ መመሪያ በተመሳሳይ አቀራረብ ምልከታንና መደምደሚያን ይለያል።

ከመደምደሚያው በፊት ምልከታውን ይጻፉ። “በ24 ሰዓታት በLevine EMB ላይ እንደ እይታ አቅጣጫው የሚለዋወጥ አረንጓዴ ነጸብራቅ ያላቸው ጥቁር ሰማያዊ ጥቁር ኮሎኒዎች፣ ከከፍተኛ የላክቶስ ፍላት ጋር የሚስማሙ” የሚለው በማስረጃ ሊደገፍ ይችላል። “E. coli፣ ተረጋግጧል” ለማለት ግን ሳህኑ ብቻውን ሊያቀርበው የማይችለው የማረጋገጫ ደረጃ ያስፈልጋል።