Wie het die pers bloedkleuring ontwikkel? Metileenblou, Malachowski, Romanowsky en Giemsa

Eosien is rooi. Metileenblou is blou. Meng die twee, wend die mengsel op ’n gedroogde bloedsmeer aan, en dele van die smeer word pers.

Nie elke deel nie. In ’n goeie preparaat word die kerne van witbloedselle rooipers, en binne ’n malariaparasiet neem die chromatien dieselfde kleur aan, terwyl die omliggende rooibloedselle pienk bly en die sitoplasma grysblou bly. Die pers maak dit moontlik om die seltipes van mekaar te onderskei.

Nie een van die bottels bevat pers nie. Die kleur verskyn slegs wanneer ’n bepaalde afbraakproduk van metileenblou met eosien op die voorwerpglas in aanraking kom, en in die 1880’s en 1890’s het niemand geweet dat dié produk bestaan nie, wat nog te sê wat dit was. Die mense wat die kleur nagejaag het, het alleen met onsuiwer kleurstowwe gewerk, sonder ’n betroubare manier om vas te stel wat in ’n bottel was nadat dit twee maande op ’n rak gestaan het.

Daarom het die vraag in die titel meer as een verdedigbare antwoord, en daarom het die antwoord in 2011 verander.

’n Waarneming wat saam met die mengsel verander het

Die kleuring is nie uitgevind nie. Dit het stelselmatig ontwikkel. Elke verandering aan die mengsel het presies een nuwe stukkie sigbare inligting opgelewer, en die volgorde van daardie stukkies is die duidelikste manier om die geskiedenis te lees.

Die patroon in die laaste kolom is die belangrike een. Elke vordering het die kleurreeks uitgebrei, en elke uitbreiding het nog een struktuur sigbaar gemaak. Die pers is nie ’n versiering van die tegniek nie; dit is die verskil tussen om te sien dat ’n parasiet teenwoordig is en om te sien waaruit dit bestaan. Hoe die kleurstof self uit ’n BASF-kleurstoffabriek tot in die geneeskunde gekom het, is ’n langer geskiedenis met sy eie dokumente. Die volledige volgorde hier bo, met die bron agter elke inskrywing, word as ’n tydlyn van bydraers met bronskakels bewaar.

Figuur: dieselfde ses mengsels, voorgestel as wat in die bakkie was en wat daaruit gekom het. Die sirkels bevat die kleurstowwe; die blokkies daaronder bevat die kleure wat dié kleurstowwe in ’n bloedsmeer kon oplewer. Niks voor 1890 toon ’n rooipers blokkie nie, en niks daarna laat een weg nie.

Die man wat boraks doelbewus gebruik het

Ernst Malachowski was ’n geneesheer in Breslau, nou Wrocław, wat sy loopbaan in privaat praktyk en in ’n klein kliniek deurgebring het wat hy saam met ’n kollega bestuur het, terwyl hy in sy eie tyd laboratoriumwerk gedoen het. Hy is op 12 Maart 1857 in Strzelno gebore, het geneeskunde aan die Universiteit van Breslau gestudeer en het van 1882 tot 1887 as assistent in interne geneeskunde by die Allerheiligehospitaal gewerk, destyds die tweede grootste hospitaal in Duitsland.

Hy het in 1888 met Chęciński en Plehn se dubbelkleuring begin. In ’n preparaat wat in 1889 gemaak is, het hy gesien dat die chromatien van die plasmodiumkern anders as die sitoplasma kleur, maar toe gevind dat hy dit nie kon reproduseer nie. Hy het probeer om die metileenblou suurder te maak, wat dinge vererger het. Hy het probeer om dit met boraks alkalies te maak, wat elke keer gewerk het. Hy het die metode op 15 Junie 1890 in die openbaar gedemonstreer en in Augustus 1891 ’n vollediger beskrywing gepubliseer, met die boraksinstruksie ingesluit. Hy het opgemerk dat die kleuring vier-en-twintig uur geneem het en dat die resultate maklik reproduceerbaar was.

Vier-en-twintig uur is lank in ’n diagnostiese laboratorium, en sy artikel het nie breedvoerig oor die persrooi kleur van die parasietkern uitgewei nie. Wat ook al die rede, niemand het die doelbewuste alkalisering van metileenblou voortgesit totdat Nocht dit in 1898 weer gedoen het nie. Malachowski het nooit weer oor bloedkleuring geskryf nie.

Die rede waarom daar tot onlangs so min oor hom bekend was, lê in die argiewe eerder as in enige raaisel. Byna geen spoor van sy lewe het in die mediese literatuur behoue gebly nie, en wat wel behoue gebly het, het langs een roete gekom. Sy dogter Marie het Duitsland in 1939 na Londen verlaat, in die Britse leër gedien en haar in Kanada gevestig, en haar versameling familiedokumente het by die Leo Baeck-instituut in New York beland. Haar broer Leo het in die Eerste Wêreldoorlog gesneuwel. Haar suster Eva is in April 1942 van Breslau na die Izbica-deurgangskamp gedeporteer en het nooit teruggekeer nie. Haar moeder Hedwig het op 22 April 1942 haar eie lewe geneem eerder as om op dieselfde deportasie te wag. Malachowski is in 1934 oorlede, voor enige hiervan.

’n Familiegeskiedenis wat só eindig, is ’n familiegeskiedenis waarna daar nie meer verwys word nie. Die twee artikels wat Malachowski weer deel van die ontwikkeling van die kleuring gemaak het, albei in 2011 gepubliseer, is saamgestel uit argiefdokumente in Poznań en Wrocław en uit Marie se dokumente in New York.

’n Muf bottel en ’n gelukkige Rus

Dmitri Romanowsky het geneeskunde aan die Militêre Mediese Akademie in Sint Petersburg gestudeer en vir die grootste deel van sy loopbaan aan malaria gewerk. In 1890 het hy ’n metode gepubliseer wat op papier byna identies aan Chęciński s’n was: onveranderde metileenblou en eosien, met ’n bietjie meer eosien.

In September 1891 het hy die metode gepubliseer wat hom beroemd gemaak het, en die belangrike besonderheid was in die instruksies versteek. Sy beste resultate het gekom van die vorräthige Methylenlösung, ’n voorraadoplossing van metileenblou wat meer as twee maande gestaan het met skimmel wat daarop gegroei het. Die skimmel en die staantyd het die kleurstof gedeeltelik gedemetileer. Romanowsky het dit nie geweet nie en kon dit nie beheer nie, en ander navorsers wat sy metode probeer het, kon nie die pers verkry nie. Sy proefskrif is in Junie 1891 in Sint Petersburg ingedien, en daarom beskou die standaardweergawe 1891 as die jaar van ontdekking.

Malachowski se demonstrasie was in Junie 1890, meer as ’n jaar vroeër, en sy metode het doelbewus gewerk.

Waarom die kleuring na die verkeerde man vernoem is

Die saak ten gunste van Malachowski is deur Kristine Krafts, Ernst Hempelmann en Barbara Oleksyn saamgestel, en berus op vier dinge. Die datum van die openbare demonstrasie, Junie 1890 teenoor September 1891. Die woord doelbewus teenoor die woord toevallig. Die feit dat Malachowski sy metode, boraks en al, gepubliseer het, terwyl Romanowsky s’n van ’n onbeheerde veranderlike afhanklik was. En die waarneming dat die beskrywing van die plasmodiumkern, saam met die pers wat dit sigbaar gemaak het, sewe jaar lank feitlik uit die literatuur verdwyn het, omdat niemand die toevallige weergawe kon reproduseer nie.

Hulle is reguit oor die gevolgtrekking. In die biografiese artikel noem hulle die toeskrywing “’n klug”, en hulle haal Ralph Lillie aan, wat in 1978 geskryf het dat “ons miskien na hierdie familie van kleurings as Malachowski-kleurings behoort te verwys”.

Die aanspraak word betwis, soos aansprake op voorrang gewoonlik word, en dit is die moeite werd om die aard van die geskil te verduidelik eerder as om dit te besleg. ’n Argument oor voorrang moet sê wat die ontdekking was. As die ontdekking die pers kleur is, het Malachowski die vroeëre gedokumenteerde demonstrasie. As die ontdekking die gepubliseerde metode is, het albei mans in 1891 gepubliseer en is die kleuring na Romanowsky vernoem. As die ontdekking die verklaring is, het nie een van die mans ’n aanspraak nie, omdat nie een geweet het dat rypwording demetilering was nie en nie een kon sê waarom die kleur hoegenaamd verskyn het nie. Daardie laaste punt is die een wat populêre weergawes oorslaan. Die aktiewe bestanddeel was ’n onsuiwerheid wat niemand geïdentifiseer het nie, en die eerste persoon wat die kleur doelbewus verkry het, het dit met ’n reproduceerbare empiriese resep gedoen, nie met ’n begrip van wat die resep gedoen het nie.

Die twee artikels van 2011 is die volledigste gepubliseerde uiteensetting van die saak ten gunste van Malachowski, en albei kan gratis by PubMed gelees word: die lang oorsig by PMID 21235291 en die biografiese artikel by PMID 21660627. Die PubMed-rekord vir die oorsig lys ook ’n kommentaar daarop, wat later daardie jaar in dieselfde tydskrif by 86(5):366 gepubliseer is. Dit is ’n gepaste herinnering dat die argument reeds met sy verskyning in druk betwis is.

Wat die geskil nie is nie, is ’n meningsverskil oor chemie. Almal wat betrokke is, stem saam oor wat die pers is en watter komponente dit oplewer. Die meningsverskil gaan oor wie eerste daar uitgekom het, en oor of ’n ongeluk wat niemand kon herhaal nie, enigsins tel as om daar uit te kom.

Wat die latere name opgelewer het

As Malachowski die pers eerste verkry het, waarom dra die kleuring die name van Romanowsky, Wright en Giemsa?

Omdat ’n kleuring wat een keer in die hande van sy uitvinder werk, nie ’n reagens is nie. Die latere werk het ’n wisselvallige mengsel verander in iets wat ’n tegnikus in ’n ander land op ’n Dinsdag kon gebruik.

Nocht het deur redenering daar uitgekom. Nadat hy nie ’n betroubare resultaat met ’n eenvoudige neutrale kleurstof kon verkry nie, het hy tot die gevolgtrekking gekom dat die pers van iets in die metileenblou moes kom wat nie metileenblou was nie, en daarna gaan soek. Unna het reeds opgemerk dat verouderde metileenblou-oplossings mastselle se korrels rooi gekleur het, en voorgestel dat ’n nuwe stof gevorm het namate die kleurstof ryp geword het. Bernthsen het in 1885 getoon dat alkaliese toestande metielgroepe van metileenblou verwyder, en dat hierdie produkte is wat ons nou die azure-kleurstowwe noem. Nocht het die aktiewe fraksie met chloroform geëkstraheer en kon dit slegs Rot aus Methylenblau, rooi uit metileenblou, noem; Michaelis het dit in 1901 azure I genoem. Jenner het die logistiek opgelos. Deur die metileenblou- en eosienneerslag weer in absolute metanol op te los, het hy ’n enkele stabiele oplossing verkry wat die smeer gefikseer het terwyl dit gekleur het en hittefiksering oorbodig gemaak het. Leishman en Reuter het polichrome kleurstof met ’n alkoholiese oplosmiddel gekombineer en stabiliteit saam met die pers verkry. Wright het ’n inkubasie van twaalf uur by 65 °C en tien dae se staantyd met ’n uur in vloeiende stoom vervang. Giemsa het heeltemal opgehou om op ’n lukraak rypgeworde oplossing staat te maak en het afgemete hoeveelhede bekende kleurstowwe met gliserol in die metanol gebruik sodat die produk tropiese hitte kon weerstaan. Hy het nooit gepubliseer hoe hy suiwer metileenazure gemaak het nie. Hy het dit aan dr. Grübler se laboratorium in Leipzig verkoop, wat dit as azure I bemark het en beweer het dat slegs sy weergawe egte Giemsa-kleurstof was.

Daar word steeds oor die identiteit van daardie azure gedebatteer. Sommige meen dat dit bloot polichrome metileenblou was, ander dat dit ryk aan Azure B was. Die antwoord het uit ’n oorlog gekom. Toe Duitse kleurstowwe onverkrygbaar geword het, het ’n span van die United States Public Health Service, Ralph Lillie saam met Maurice Roe en Aimee Wilcox, gevind dat die beste kleuring uit drie geskeide komponente gekom het: onveranderde metileenblou, sy gedemetileerde afbraakproduk Azure B, en eosien. Azure B het die onverkrygbare azure I vervang, en daardie drie komponente is steeds die grondslag van die kleuring wat vandag gebruik word om malaria te diagnoseer.

Die chemie van hoe dié drie komponente op ’n voorwerpglas in wisselwerking tree, is ’n aparte vraag en hoort op ’n ander bladsy. Die rolle van kleurstowwe en die chemie van Romanowsky-tipe kleurings behandel wat Azure B en eosien elk doen en waarom die paar ’n kleur oplewer wat nie een alleen oplewer nie. Wat die bladsy oor mikroskopie en laboratoriumtoepassings behandel, is die praktiese kant: wat ’n gegewe preparaat wys, en hoe om te beoordeel of ’n bepaalde produk geskik is vir die metode wat jy wil gebruik.

Die deel van die geskiedenis wat steeds ter sake is

Een besonderheid in hierdie verhaal het nie in 1902 opgehou om waar te wees nie. Vir ongeveer vyftig jaar was die belangrikste komponent van die wêreld se standaardmalariakleuring ’n onbenoemde onsuiwerheid. Dit was per ongeluk daar, die hoeveelheid daarvan het tussen bottels gewissel, die identiteit daarvan was vir ’n deel van daardie tyd ’n handelsgeheim, en die verhouding daarvan is tot in die 1940’s betwis. Die mense wat die kleuring gebruik het, was nie onverskillig nie. Hulle het geen manier gehad om te weet wat in die bottel was nie.

Die moderne weergawe van dieselfde probleem is ’n spesifikasie wat slegs ’n deel van die materiaal beskryf. Voldoening aan USP is die roete na die hoogste suiwerheid wat die mark bied, omdat dit ’n volledige gepubliseerde standaard is eerder as ’n enkele meting: identiteit, suiwerheid, organiese onsuiwerhede insluitend die azure-kleurstowwe, residuele oplosmiddels, elementêre onsuiwerhede, gloeiresidu, mikrobiese limiete en bakteriële endotoksiene. Blupreme verkry sy metileenblou van ’n farmaseutiese vervaardiger en publiseer die volledige ontledingsertifikaat, sodat elke reël van daardie lys nagegaan kan word eerder as bloot beweer kan word. ’n Sertifikaat wat ’n swaarmetaalresultaat rapporteer en dit voldoening aan USP noem, is die hedendaagse ekwivalent van ’n bottel met die etiket “rypgeworde metileenblou”: moontlik ’n goeie reagens, maar die etiket vertel jou nie wat daarin is nie.