Metileenblou in sebravisnavorsing: versorgingsbymiddel en eksperimentele verwarrende faktor

Sebravis-eierwater is dikwels ligblou, en byna niemand teken aan waarom nie. Die kleurstof is metileenblou, wat teen swamme bygevoeg word, en die meeste protokolle behandel dit as agtergrond. Agtergrond is hier die verkeerde begrip. ’n Beter een is ’n ongelyste eksperimentele faktor: iets wat in behandelde bakkies aanwesig en in kontroles afwesig is, farmakologies aktief is by die konsentrasies wat gebruik word, en die einste eindpunte wat die eksperiment meet, kan verskuif.

Daardie onderskeid vorm die grondslag van alles hieronder. Roetineversorging teen swamme is een vraag. Of die bymiddel neutraal is ten opsigte van jou toets, is ’n ander. Die onlangse sebravisliteratuur beantwoord die eerste gerusstellend en die tweede ongemaklik.

Wat die riglyne werklik voorskryf

Daar is geen enkele standaard nie, en dit is deel van die probleem. Die Canadian Council on Animal Care se riglyne laat 0.5 mg/L, of 0.00005%, in vervoeroplossing vir eiers en larwes toe om swamgroei te verminder. Europese riglyne vir laboratoriumdiere beskryf embrio’s wat in ’n medium aangehou word wat dikwels dieselfde 0.00005% bevat. Die Cold Spring Harbor E3-resep spesifiseer twee keer soveel, 1 mg/L of 0.0001%, as ’n resepbestanddeel. Hierteenoor staan ’n opvallende weglating: die OECD-riglyn vir die visembrio-toksisiteitstoets spesifiseer hersaamgestelde verdunningswater en die toetschemikalie, sonder enige aanbeveling oor metileenblou in óf die 2013-weergawe óf die latere hersiening. Een laboratorium maak dus sebravisembrio’s met metileenblou in blou water groot vanaf die eerste lewensure, ’n ander voer die regulatoriese embriotoets in helder water uit, en albei noem hul medium normaal. Enigiemand wat resultate tussen laboratoriums vergelyk of historiese kontroles saamvoeg, erf daardie teenstrydigheid.

Om die konsentrasies in konteks te plaas: 0.00005% is ongeveer 1.56 micromolar en 0.0001% ongeveer 3.13 micromolar. Dit is lae getalle, en dit is aanloklik om hulle as te laag om saak te maak, te beskou. Die studies hieronder toets presies daardie aanname, by presies daardie konsentrasies.

Lesers wat uit die vishoustokperdjie eerder as die laboratorium kom, ontmoet dieselfde molekule in ’n ander omgewing, wat in die akwariumgids oor metileenblou bespreek word. Die chemie is dieselfde; die bespreking van hoe die kleurstof elektrone deur selle vervoer, verduidelik waarom ’n redoksaktiewe verbinding telkens in metabolismeartikels opduik. Wat volg, is spesifiek van toepassing op sebravis-eierwater met metileenblou.

Metabolisme: die effek verander van rigting met die stadium

Die mees insiggewende studie het normaal ontwikkelende sebravisse vanaf die eerste lewensdag tot 5 dae ná bevrugting blootgestel en oksidatiewe metabolisme in elke stadium gemeet, soos die gepubliseerde verslag van die embrio-metabolisme-eksperimente beskryf. Die patroon verdien ’n noukeurige uiteensetting omdat dit van rigting verander.

Op 1 dag ná bevrugting het basale suurstofverbruik in blootgestelde embrio’s by albei versorgingskonsentrasies gestyg. Op 2 dae was die mitochondriale membraanpotensiaal in die oppervlaklaag van die larwes verhoog by blootstellings van 0.00005%, 0.0001% en 0.0003%. Teen 4 tot 5 dae, ná uitbroei, het die rigting omgekeer: oksidatiewe energieverbruik het gedaal, ongeag of blootstelling sedert bevrugting aaneenlopend was of slegs akuut van dag 3 tot dag 4 plaasgevind het. Terselfdertyd het transkripte vir subeenhede van mitochondriale respiratoriese komplekse op sowel 1 as 4 dae afgeneem, saam met transkripte wat met steroïdogenese en glukoneogenese verband hou.

Twee verdere waarnemings maak die prentjie duideliker. Uitbroei het effens vroeër plaasgevind by die hoër versorgingskonsentrasie, met blootgestelde embrio’s wat op 2 dae voor was en kontroles wat teen dag 3 ingehaal het. En die stres-as self het ongeskonde geblyk: toe 5-dae-oue larwes aan ’n draaibeweging as stressor onderwerp is, het heellyfkortisol in albei groepe normaal gestyg. Die kleurstof is dus nie ’n algemene ontwikkelingsgif by hierdie dosisse nie, en dit demp nie elke fisiologiese reaksie nie. Dit verskuif energiemetabolisme op ’n stadiumafhanklike manier: opwaarts voor uitbroei en afwaarts daarna.

Gedrag: waarom twee studies verskil, en waarom albei reg kan wees

Die gedragsliteratuur lyk teenstrydig totdat die blootstellingsontwerpe langs mekaar geplaas word. Een veiligheidstudie oor ontwikkeling en gedrag het embrio’s vanaf ongeveer 6 uur ná bevrugting aan konsentrasies tot 10 micromolar blootgestel, die oplossings daagliks tot en met dag 4 vervang, en die larwes daarna vir dae 5 en 6 na kleurstofvrye medium oorgeplaas en beweging op dag 6 in ’n lig-donker-toets getoets. Die resultaat: geen beduidende effek op sterfte, uitbroei of morfologie nie, en geen behandelingseffek op beweging nie. Die outeurs het redelikerwys 10 micromolar as ’n boonste grens onder hul toestande aanbeveel.

’n Tweede groep, met sommige van dieselfde outeurs as die metabolismestudie, het die blootstelling uitgevoer soos versorging in die praktyk werk: die kleurstof was vanaf 2 tot 3 uur ná bevrugting aanwesig, met daaglikse gedeeltelike vervanging, en gedrag is gemeet terwyl blootstelling nog aan die gang was of onlangs plaasgevind het. By dieselfde roetinekonsentrasies het larwes verminderde beweging in ’n 24-uur-toets getoon, wat oor stamme en laboratoriums heen herhaalbaar was, en die studie oor gedragsverwarring het die effek met serotonergiese tonus verbind, in ooreenstemming met die kleurstof se bekende remming van monoamienoksidase. Die mees veelseggende bevinding was dat embriomedium wat metileenblou bevat, die verwagte bewegingsreaksie op die SSRI fluoksetien gemaskeer het. ’n Siftingstoets wat in blou water uitgevoer word, kan dus ’n geneesmiddeleffek miskyk wat helder water sou openbaar.

Daar is geen werklike teenstrydigheid nie. ’n Verbinding kan twee dae ná uitwassing in een toets geen waarneembare oorblywende effek hê nie, en steeds aktief wees terwyl dit in ’n ander aanwesig is. Die praktiese gevolgtrekking is dat die nulbevinding ’n boonste konsentrasiegrens regverdig, nie ’n aanspraak op neutraliteit nie, terwyl die positiewe bevinding die tersaaklike risiko beskryf: aktiewe blootstelling gedurende die meetvenster, in presies die opset wat die meeste laboratoriums gebruik.

’n Redokskleurstof binne ’n redokstoets

Nog ’n slaggat verdien sy eie paragraaf omdat dit die meetinstrument eerder as die dier beïnvloed. Die Alamar Blue-toets vir energieverbruik berus self op redokschemie: resasurien word tot fluoresserende resorufien gereduseer. Metileenblou berus ook op redokschemie. In selvrye kontroles het albei versorgingskonsentrasies Alamar Blue-fluoressensie ná 24 uur effens maar beduidend verlaag. In die diereksperimente is blootgestelde embrio’s minstens drie keer in kleurstofvrye medium gewas voordat die toets uitgevoer is, en die biologiese effek in uitgebroeide larwes het die selvrye interferensie oorskry. Albei stellings is dus waar: gewaste diere toon ’n werklike metaboliese effek, en kleurstof wat nie uitgewas is nie, voeg ’n direkte chemiese artefak daarby. Kontroles moet die twee skei, anders beteken geen van die getalle iets nie. Algemene riglyne oor die interpretasie van kleurstofgebaseerde toetsresultate is hier besonder sterk van toepassing.

Tydlyn van ontwikkelingstadiums

Die oorspronklike hulpmiddel vir hierdie artikel. Konsentrasies is die twee standaardversorgingswaardes, 0.00005% en 0.0001%, tensy anders aangedui.

Die patroon om te onthou, is ’n vroeë styging en ’n latere daling in metaboliese eindpunte, met gedragseffekte wat tydens blootstelling aanwesig is en ná uitsuiwering nie waarneembaar is nie in die een toets wat dit ondersoek het.

Kontrolelys vir kontrole-ontwerp

Die tweede oorspronklike hulpmiddel. Gebruik dit wanneer sebravisprotokolle met metileenblou deel van ’n eksperiment vorm.

1. Rapporteer die kleurstof as ’n reagens, nie as water nie. Meld die konsentrasie in sowel persentasie as micromolar, die begin en einde in ure of dae ná bevrugting, die vervangingskedule en die uitwasinterval voor elke meting.
2. Pas kontroles by die vraag aan. ’n Studie van die toetschemikalie vereis kleurstofvrye kontroles; ’n versorgingstudie vereis kleurstofvrye groepe teenoor groepe met kleurstof, met die uitkoms teen swamme aangeteken, aangesien geen van die aangehaalde studies doeltreffendheid teen swamme gemeet het nie.
3. Was voor redokstoetse, en verifieer dan. Spoel minstens drie keer in kleurstofvrye medium en voer terselfdertyd ’n selvrye kontrole met kleurstof plus reagens uit, omdat die kleurstof die Alamar Blue-sein direk verlaag.
4. Beskou gedrags- en monoamieneindpunte as hoërisiko. Studies van beweging, skrikreaksies, angsagtige gedrag, antidepressante en MAO-remmers moet die kleurstof tydens meting vermy of eindpuntspesifieke neutraliteit aantoon; uitwassing van een tot twee dae het een bewegingseffek verwyder, maar is nie vir ander paradigmas bewys nie.
5. Beskou metaboliese en mitochondriale eindpunte in elke stadium as hoërisiko. Suurstofverbruik, energieverbruik, membraanpotensiaal en respiratoriese-kettingtranskripte verander by versorgingskonsentrasies, in teenoorgestelde rigtings voor en ná uitbroei.
6. Moenie neutraliteit van een ontwerp na ’n ander oordra nie. ’n Nulbevinding ná uitwassing geld nie vir voortgesette blootstelling nie; ’n nulbevinding vir morfologie geld nie vir metabolisme of geneesmiddelinteraksie nie; ’n resultaat by een stam, temperatuur of toetsduur geld nie vir ander nie.
7. Meld die riglyn wat jy gevolg het en die alternatief daarvoor. Noem CCAC-, Europese of Cold Spring Harbor-konsentrasies uitdruklik, en dui aan waar die OECD-embriotoets die kleurstof weglaat, sodat ’n leser kan bepaal binne watter raamwerk jou diere val.

Niks hiervan is ’n argument teen die gebruik van die kleurstof om eiers lewendig te hou nie. Dit is ’n argument daarteen dat ’n versorgingskeuse sonder ondersoek in die data beland. Die blou in die bakkie is ’n molekule met ’n farmakologie, en die eksperimente wat die waarskynlikste verwring sal word, is juis die hoëdeurset-metaboliese en -neurogedragsiftingstoetse waarvoor jong sebravisse nou verkies word. Teken dit aan, beheer dit, was dit uit voordat jy meet, en kontroleer die toets waaraan dit dalk ongemerk deelneem.