Metileenblou vir DNA- en RNA-kleuring: jel- en membraantoepassings

'n Student laat 'n agarosejel loop, kleur dit met metileenblou en sien niks waar 'n helder band verwag is nie. By die volgende werkstasie kleur 'n nadoktorale navorser 'n Northern-membraan met dieselfde blou bottel en kry binne drie minute skerp ribosomale bande. Die student kom tot die gevolgtrekking dat die jel misluk het. Die jel het nie misluk nie. Die twee take was verskillend, en dieselfde kleurstof beantwoord hulle met verskillende sensitiwiteit, verskillende agtergrond en verskillende reëls vir wat daarna gebeur.

DNA-kleuring en RNA-kleuring met metileenblou deel dieselfde chemie, maar nie dieselfde doel nie. In 'n jel wys die kleurstof hoeveel nukleïensuur binne 'n poreuse matriks voorkom. Op 'n membraan wys dit of die oordrag gewerk het en of die bane eweredig gelaai is. Sodra dié onderskeid duidelik is, val die protokolle, opsporingsgrense en verenigbaarheidsgrense in plek.

Die kort antwoord

Metileenblou is 'n planêre kationiese kleurstof wat niekovalent en omkeerbaar aan nukleïensure bind deur 'n kombinasie van elektrostatiese aantrekking tot fosfaat, interkalasie tussen basispare en assosiasie met die klein groef. Daardie omkeerbaarheid is die kern daarvan. Bande kan gekleur en met sigbare lig gedokumenteer word, en daarna ontkleur of gesuiwer word vir klonering, hibridisasie of herondersoek met 'n sonde.

Vir metileenbloukleuring van dubbelstring-DNA in agarosejelle is die standaard vinnige resep 0.02 persent w/v (200 mikrogram per mL) in water, met ongeveer 15 minute se kleuring plus ongeveer 15 minute se ontkleuring in water, en waarneming op 'n witligkas. Vir membrane is die klassieke Northern-kladresep 0.02 tot 0.04 persent kleurstof in natriumasetaat naby pH 5.2, met etlike minute se kleuring ná oordrag en immobilisering, gevolg deur 'n waterspoeling en volledige ontkleuring voor hibridisasie. Die sensitiwiteit is beskeie: tientalle tot honderde nanogram per jelband onder goeie toestande, en konserwatiewe riglyne gee 0.5 tot 1 mikrogram aan. Dit is ordes van grootte hoër as vir etidiumbromied- en SYBR-kleurstowwe. Op membrane is daar geen bruikbare opsporingsgrens vir 'n enkele transkrip nie, omdat die kleurstof hoofsaaklik volop ribosomale RNA en die totale gelaaide materiaal wys. Moenie 'n aanvullingoplossing uit die kleinhandel in enige van die twee resepte gebruik nie. Gevalideerde metodes veronderstel kleurstof van analitiese graad, gedefinieerde buffers en RNase-vrye hantering waar RNA betrokke is.

Hoe binding werk, en waar dit mislei

Die bruikbare model het drie dele. Eerstens word die positief gelaaide ringstelsel tot die negatief gelaaide fosfaatruggraat aangetrek. Spektroskopiese werk vind dat hierdie elektrostatiese komponent by lae soutkonsentrasies oorheers, terwyl modellering en molekulêre dinamika interkalasie en binding aan die klein groef as stabiele bindingswyses vir dubbelstring-DNA ondersteun, soos opgesom in 'n spektroskopiese studie van metileenblou-DNA-binding. Tweedens bestaan daar 'n mate van GC-voorkeur, met modellering wat CpG- en GpC-stappe bevoordeel en eksperimente wat voorkeurassosiasie met GC-ryke duplekse rapporteer in werk oor metileenblou se interkalasievoorkeure, maar AT-duplekse bind ook. Roetinekleuring is nie volgordespesifiek nie. Derdens bind enkelstring-DNA en RNA hoofsaaklik deur elektrostatiese interaksies en stapeling met toeganklike basisse en dupleksstreke, wat verklaar waarom kleuringsintensiteit met lengte, volgorde en sekondêre struktuur wissel.

Twee gevolge volg hieruit. Omdat binding niekovalent is, was die kleurstof uit. Poliakrielamiedbande vervaag vinnig tensy hulle doelbewus gefikseer word, en 'n spesiale variant vir permanente fiksasie bestaan juis omdat normale kleuring tydelik is, soos beskryf deur Soto en Draper vir PAGE-jelle. Omdat die kleurstof 'n fotosensitiseerder is, kan langdurige helder beligting van gekleurde DNA in die teenwoordigheid van suurstof guanien oksideer en uiteindelik enkelstringbreuke veroorsaak, 'n meganisme wat uiteengesit word in werk oor metileenblou-gesensitiseerde guanienoksidasie. Kort waarneming onder wit lig vermy die bekende UV-skade van klassieke etidiumbromiedwerkvloeie, en dié voordeel is werklik vir preparatiewe herwinning. Sigbare lig is sagter, nie onskadelik nie. Hou beligting kort wanneer die DNA gekloneer gaan word. Vir die breër fotochemie agter hierdie waarskuwing, sien die twee roetes in metileenbloufotochemie. Vir die redokspaar en ladingstoestande wat verklaar waarom die geoksideerde vorm bind en die gereduseerde vorm nie, sien die chemie van metileenblou se struktuur en eienskappe.

Taak een: kleuring binne jelle

Jelkleuring beantwoord een vraag: is daar genoeg nukleïensuur in hierdie band om dit met die oog te sien? Dubbelstring-DNA in agarose is die geval wat die beste gekarakteriseer is. Die oorspronklike metileenblou-jelmetode van Flores en kollegas het die vinnige 0.02 persent-protokol op 1 persent agarose gevalideer en suksesvolle herwinning en klonering daarna getoon. Dieselfde verskafferprotokol verskyn op die IBI Scientific-metileenblouprodukblad, wat die 0.04 persent-membraanresep en die vinnige jelvariant langs mekaar lys.

Praktiese werkvloei:

1. Laat die jel normaalweg loop. Kleur ná elektroforese, nie tydens dit nie, tensy oordrag of resolusie vir 'n gewysigde metode gevalideer is.
2. Dompel dit ongeveer 15 minute lank in 0.02 persent w/v metileenblou in gedistilleerde water, met sagte beweging.
3. Ontkleur met verskeie vervangings van die water, ongeveer 15 minute altesaam, totdat die matriksagtergrond afneem en die bande uitstaan.
4. Fotografeer dadelik op 'n witligbeligter.

Agarose en poliakrielamied gedra hulle verskillend. Agarose behou kleurstof in die matriks, dus is ontkleuring die stadige stap. Dun poliakrielamiedjelle kleur vinnig, maar verloor ook vinnig kleurstof, wat preparatiewe uitsny help en argiefrekords benadeel. Sintetiese oligonukleotiede in poliakrielamied kan met dieselfde 0.02 persent-resep binne 20 tot 30 minute opgespoor word met herhaalde waterspoelings, volgens gevestigde PAGE-metodes in die styl van Current Protocols. Baie verdunde variante naby 0.0002 persent in verdunde TBE is vir preparatiewe oligonukleotiede oor etlike ure gerapporteer, maar die bewysbasis is swakker.

Die verskil tussen DNA en RNA maak saak. Dubbelstring-DNA lewer die sterkste gestruktureerde binding. RNA en enkelstring-DNA kleur wel, maar swakker en minder voorspelbaar. Vir formaldehied-agarose-RNA-jelle slaan die meeste laboratoriums bloukleuring binne die jel oor en dra die RNA eers na 'n membraan oor, waarna dit daar gekleur word. Dié stap verruil 'n swak jelsein vir 'n skerper membraansein plus 'n rekord van die lading.

Taak twee: kleuring op membrane

Membraankleuring beantwoord 'n ander vraag: het die oordrag gewerk, en is die bane vergelykbaar? Die klassieke toepassing is Herrin en Schmidt se omkeerbare Northern-kladkleuring, oorspronklik met 0.04 persent kleurstof in 50 mM natriumasetaat by pH 5.0 vir 2 tot 3 minute, gevolg deur 'n waterspoeling, en verwyderbaar met verdunde SDS in SSPE voor hibridisasie.

Die wyd gebruikte moderne variant verloop soos volg:

1. Dra RNA of gedenatureerde DNA na nylon of nitrosellulose oor en immobiliseer dit dan deur UV-kruisbinding of verhitting sodat die monster nie tydens kleuring verlore gaan nie.
2. Opsioneel maar algemeen: benat die membraan ongeveer 15 minute lank in 5 persent asynsuur.
3. Kleur 5 tot 10 minute lank in 0.02 tot 0.04 persent metileenblou in 0.3 tot 0.5 M natriumasetaat naby pH 5.2.
4. Spoel en ontkleur 5 tot 15 minute lank in water, dokumenteer dit en verwyder dan die oorblywende kleurstof voor hibridisasie.

Positief gelaaide nylon oorheers in Northern-werk. Nitrosellulose werk ook met dieselfde werkvloei van asynsuur plus asetaat. Die beeld word gebruik om oordrag te bevestig, 28S- en 18S-bande te vergelyk (of 23S en 16S vir bakteriële RNA), lere en standaarde te merk en 'n benaderde rekord vir normalisering op grond van totale RNA te hou. Gepubliseerde Northern-metodes kwantifiseer gekleurde ribosomale bande vir ladingskontroles, insluitend suiwelwetenskaplike werk wat metileenblougekleurde ribosomale bande vir normalisering gebruik het. Southern-membrane kan op dieselfde manier gevisualiseer word, maar die kleurstof is baie meer gevestig as 'n Northern-ladings- en oordragkontrole, en Southern-DNA word voor oordrag gedenatureer, dus is die sensitiwiteitsyfers vir jelle nie direk toepaslik nie.

Opsporingsgrense en agtergrond: waar blou tekortskiet

Die vergelyking hieronder is doelbewus benaderd. Kleurstofprestasie hang af van die jelpersentasie, bandwydte, optika en noukeurige ontkleuring. Beskou elke getal as 'n orde van grootte, nie 'n spesifikasie nie.

Agtergrondbeheer bepaal of die beskeie sein bruikbaar is. Vrye kleurstof is intens gekleur, dus kom kontras uit die verwydering van ongebonde kleurstof sonder om gebonde kleurstof te verwyder. Meer gekonsentreerde kleurstof verhoog selde die sensitiwiteit. Dit verleng hoofsaaklik die ontkleuringstyd. Voer 'n verdunningsreeks op presies dieselfde jel, membraan en kamera uit, en gebruik slegs die gebied waar geïntegreerde digtheid eweredig aan die inset bly. Metileenblou ondersteun semikwantitatiewe normalisering van lading. Dit is nie 'n kwantitatiewe toets met 'n groot dinamiese omvang nie, omdat membraankapasiteit, oordragdoeltreffendheid, versadiging en ontkleuring van baan tot baan verskil.

Verenigbaarheidsgrense: wat kleuring oorleef

Klonering ná bloukleuring is gedemonstreer. Flores en kollegas het gekleurde agarosebande uitgesny, die DNA herwin en dit geligeer en vir transformasie gebruik, met beter kloneringsresultate as ná etidiumbromied met UV. Die waarskynlike rede is minder fotoskade, nie 'n voordeel van die kleurstof self nie. Hou blootstelling aan wit lig kort en onderwerp herwonne DNA aan 'n normale jel-ekstraksiesuiwering.

Vir PCR en volgordebepaling is die bewyse beperkter. Oorblywende kleurstof bind nukleïensure, dus moet dit ontkleur en gesuiwer word voor ensiematiese stappe. Behoorlik gesuiwerde DNA uit 'n blougekleurde jel behoort te werk, maar die verdraagsaamheid vir direkte kleurstofoordrag by verskillende polimerases en volgordebepalingschemieë is nie goed gekwantifiseer nie. Moenie dit aanneem nie.

Kladhibridisasie is verenigbaar wanneer die volgorde streng gehandhaaf word: dra oor, immobiliseer, kleur, dokumenteer, ontkleur, hibridiseer. Daardie volgorde is Herrin en Schmidt se ontwerp. Kleuring voor oordrag, of die weglating van ontkleuring, is 'n ander metode en vereis sy eie validering. Ná kleurstofverwydering verloop standaardsondeverwydering en herondersoek met 'n sonde normaalweg. Vir kleuring op selvlak met dieselfde kleurstoffamilie, en waarom die benadering vir gefikseerde uitstrykpreparate nie op lewendeselmetodes toepaslik is nie, sien die mikroskopiekleuringsatlas.

Banduitsny werk vir preparatiewe agarose en vir PAGE-oligonukleotiede wat met blou opgespoor word, mits die variant vir permanente fiksasie vermy word. Elektro-eluering ná ontkleuring is chemies aanneemlik vir 'n omkeerbare bindmiddel, maar beheerde opbrengsdata spesifiek vir metileenblou is skaars. Ontsout of presipiteer ná eluering.

Probleme wat herhaaldelik voorkom

Dowwe jelbande beteken gewoonlik te min massa vir 'n kolorimetriese kleurstof, veral vir kort enkelstring- of RNA-teikens. Laai meer, gebruik vars kleurstof, verleng kleuring voordat die konsentrasie verhoog word en staak ontkleuring vroeër. 'n Eenvormig blou jel sonder kontras beteken gewoonlik oorkleuring of te min watervervangings. Vervagende PAGE-bande is verwagte chemie, nie mislukte kleuring nie. Fotografeer vinnig. Ongelyke membraanagtergrond dui op voue, borrels, vingerafdrukke, ongelyke beweging of kol-kol-oordrag. Moenie dit sonder 'n hibridisasiekontrole as ongelyke lading interpreteer nie. 'n Versmeerde, swak ribosomale patroon kan afbraak beteken, maar ook onvolledige oordrag, te min totale RNA (tipiese bane bevat etlike tot tientalle mikrogram) of oormatige ontkleuring. Die kleurstof wys volop ribosomale RNA. Dit wys nie 'n spesifieke transkrip nie. Daardie taak behoort aan die sonde.

Veiligheid en hantering sonder oordrewe aansprake

Metileenblou is eenvoudiger om te hanteer as etidiumbromied, maar dit is nie onskadelik nie. 'n Huidige MilliporeSigma-veiligheidsdatablad klassifiseer die kleurstof as akute orale toksisiteit Kategorie 4, skadelik indien ingesluk, met wegdoening deur 'n goedgekeurde afvalroete volgens die Sigma-Aldrich-metileenblou-SDS. Etidiumbromied dra sterker genotoksisiteitswaarskuwings, insluitend vermoedelike kiemseleffekte in sy Sigma-Aldrich-etidiumbromied-SDS, en sy jelle en oplossings word gewoonlik afsonderlik as gevaarlike chemiese afval hanteer, soos aangedui in die Thermo Fisher-gids vir nukleïensuurkleurstowwe. Volg die SDS en institusionele reëls vir albei. Hou droë kleurstof dig toegemaak en droog, hergebruik die werkkleurstof slegs soos die protokol toelaat, bêre gekleurde membrane droog tussen filtervelle en fotografeer jelle voordat die bande wegdiffundeer.

Onthou die kernsin vir die werkbank. Jelle toets sigbaarheid by hoë lading onder wit lig. Membrane toets oordrag en lading voordat die sonde die sensitiewe werk doen. Een kleurstof dien albei, met beskeie sensitiwiteit, omkeerbare binding en 'n streng volgorde van stappe.