Die interpretasie van E. coli en ander kolonies se voorkoms op EMB-agar

'n Student stryk 'n onbekende organisme op eosien-metileenblou-agar uit, inkubeer dit oornag en keer terug na 'n plaat met donker kolonies wat groen glinster. Die aantekening in die notaboek lui "E. coli, bevestig." Daardie aantekening maak 'n sterker aanspraak as wat die plaat kan staaf. Die plaat toon 'n groei- en fermentasiefenotipe onder bepaalde toestande. Die spesie-identiteit is 'n afsonderlike aanspraak wat afsonderlike bewyse vereis.

Hierdie gids benader EMB-agarresultate as 'n interpretasietaak. Dit verduidelik die onderliggende beginsel, bespreek 'n illustratiewe plaatatlas met kontroles en wys op gevalle waar die handboekbeeld misleidend is.

Die beginsel agter die plaat

EMB-agar is sowel selektief as differensieel. Die kleurstowwe eosien Y en metileenblou onderdruk baie Gram-positiewe organismes, sodat die medium Gram-negatiewe groei bevoordeel. Dieselfde kleurstowwe dien as indikators: wanneer 'n organisme die beskikbare suiker fermenteer en genoeg plaaslike suur produseer, neem die kolonie baie kleurstof op en verkleur dit donkerpers tot blouswart. Met sterk suurproduksie kan die kolonieoppervlak 'n metaalgroen irisering toon. Die ASM-protokol vir eosien-metileenblou-agarplate beskryf hierdie kombinasie van seleksie en differensiasie en verskaf verwysingsfoto's vir onderrig.

Een besonderheid is belangrik voordat enige resultaat geïnterpreteer word: kyk watter formulering gebruik word. Die ouer Holt Harris Teague-formulering bevat laktose sowel as sukrose, terwyl Levine EMB slegs laktose bevat. 'n Organisme wat sukrose maar nie laktose fermenteer nie, soos baie Serratia marcescens-isolate, kan op die twee weergawes verskillend lyk. Die vervaardiger se dokumentasie vir EMB-media vermeld hierdie formuleringsverskil uitdruklik. Teken die vervaardiger en formulering saam met die resultaat in die notaboek aan.

Bereide, ongeïnokuleerde EMB-agar is gewoonlik rooibruin tot rooipers, soms met 'n groenerige skynsel of fyn neerslag. Daardie agtergrondkleur is nie groei nie. Vergelyk elke waarneming met 'n ongeïnokuleerde plaat of die gedokumenteerde basisvoorkoms, en beoordeel die primêre plaat ná ongeveer 18 tot 24 uur se aërobiese inkubasie by 35 tot 37 C, tensy die onderrigprotokol anders voorskryf. Verlengde inkubasie kan die fermentasievoorkoms verander.

Hoe om die plaat te bekyk

Gebruik twee soorte lig. Ondersoek die plaat eers onder weerkaatste of skuins invallende lig en kantel dit: die metaalglans is iriserend en kan na gelang van die kykhoek verskyn of verdwyn. Ondersoek dit dan met deurgelate lig om die koloniekleur en donker sentrums te beoordeel. Werk met goed geïsoleerde kolonies, aangesien digte groei en naburige kolonies die plaaslike suurophoping verander en kleur kan onderdruk of versterk. Die ASM-beeldversameling demonstreer dit regstreeks: E. coli in 'n gemengde kultuur kan sy verwagte glans verloor omdat omliggende organismes die suuromgewing verander.

Sluit kontroles in wanneer die oefening dit toelaat. 'n Algemene onderrigstel is E. coli ATCC 25922 vir die blouswart fenotipe met metaalglans, 'n niefermenteerder soos Salmonella Typhimurium ATCC 14028 of Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 vir die kleurlose fenotipe, en 'n Gram-positiewe organisme soos Enterococcus faecalis of Staphylococcus aureus as inhibisiekontrole, soos in standaardtabelle vir gehaltebeheer van EMB-media aangedui. As die positiewe kontrole geen glans toon nie, oorweeg eers inkubasie, digte groei of die formulering voordat jy die onbekende organisme bevraagteken.

Illustratiewe plaatatlas

Die plate hieronder is gegenereerde illustrasies, nie foto's van werklike kulture nie. Hulle toon die patroon waarna gesoek moet word, nie die presiese skakering van enige bepaalde stam nie. Vergelyk hulle met die ASM-verwysingsfoto's en met werklike plate uit die onderriglaboratorium.

Plaat 1: Escherichia coli op EMB-agar, sterk laktosefermenteerder

E. coli op EMB-agar is gewoonlik donkerpers tot blouswart, dikwels met 'n donker sentrum en 'n metaalgroen glans weens sterk suurproduksie. Die glans is die bekende kenmerk waarna studente soek, maar beskou dit as ondersteunende bewyse eerder as 'n bepalende kenmerk. Die intensiteit van die glans wissel na gelang van die stam, inkubasietyd, koloniedigtheid en kykhoek. Die afwesigheid van glans sluit E. coli nie uit nie, en 'n donker kolonie sonder glans kan op verskeie ander fermenteerders dui. Kies 'n goed geïsoleerde kolonie vir enige opvolgwerk eerder as om 'n sektor met digte groei te beoordeel.

Plaat 2: Klebsiella pneumoniae op EMB-agar, slymerige fermenteerder

Klebsiella pneumoniae op EMB-agar vorm gewoonlik groot, blink, slymerige kolonies in pienkpers tot bruinpers skakerings, dikwels met donker sentrums maar gewoonlik sonder 'n sterk metaalglans. Soortgelyke morfologie kom by verwante fermenteerders soos Enterobacter voor. Die slymerige tekstuur en koloniegrootte vorm deel van die interpretasie: 'n klein, plat pienk kolonie dra 'n ander gewig as 'n groot, koepelvormige, slymerige kolonie. Soos met E. coli dui die plaat op 'n fermentasiefenotipe, en identifikasie tot op spesievlak vereis die biochemiese bevestiging wat hieronder beskryf word.

Plaat 3: Salmonella op EMB-agar en ander niefermenteerders, kleurlose kolonies

Salmonella op EMB-agar en verwante organismes wat nie laktose fermenteer nie, waaronder Shigella en baie Pseudomonas-isolate, groei gewoonlik as kleurlose tot deurskynende of ligte amberkleurige kolonies. Sommige formulerings en toestande gee 'n dowwe pienkerige skynsel, dus is 'n ligpienk kolonie nie outomaties 'n fermenteerder nie. EMB onderskei nie Salmonella van Shigella of van ander niefermenteerders nie; daardie onderskeid word met latere toetse getref. Let ook daarop dat laktosepositiewe Salmonella-stamme met metaalglanskolonies soortgelyk aan dié van E. coli gedokumenteer is, wat nog 'n rede is waarom 'n enkele plaat nie 'n finale antwoord kan gee nie.

Plaat 4: Serratia marcescens en die formuleringslaggat

Serratia marcescens verdien sy eie afdeling omdat studente dikwels rooi kolonies verwag en dan die plaat verkeerd interpreteer. Die meeste kliniese isolate fermenteer nie laktose nie, en op Levine EMB lyk hulle dus gewoonlik bleek tot swak gekleurd. Omdat baie isolate sukrose fermenteer, kan 'n sukrosebevattende formulering 'n donkerder of meer suurverwante reaksie gee. Moet ook nie die klassieke rooi prodigiosienpigment by 35 tot 37 C verwag nie; pigmentproduksie is onbetroubaar by inkubatortemperatuur. Wanneer die protokol Serratia marcescens op EMB-agar noem, kyk watter formulering die stelling veronderstel. 'n Oorsig van Serratia-metabolisme som die laktosenegatiewe en sukroseveranderlike patroon agter hierdie slaggat op.

Plaat 5: kontroles en geïnhibeerde organismes

Gram-positiewe organismes soos Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus en Bacillus word oor die algemeen op EMB-agar geïnhibeer of sterk onderdruk, hoewel inhibisie nie vir elke stam volledig is nie. 'n Stel kontroles hou die interpretasie betroubaar: die E. coli-kontrole behoort goeie groei met 'n blouswart kleur en glans te toon, die niefermenteerderkontrole behoort kleurlose groei te toon, en die inhibisiekontrole behoort min of geen groei te toon nie. As die inhibisiekontrole goed groei, het die selektiewe stap misluk en is elke ander interpretasie van daardie lot verdag. Kleuringsmetodes beantwoord 'n ander vraag as kultuurmedia; vir die kleuring van voorwerpglasies in die laboratorium, raadpleeg die metileenblou-kleuringsatlas.

Vergelyking binne perke

Drie sinne som die misleidende voorkomste op. Donker beteken nie E. coli nie, aangesien Klebsiella, Enterobacter en ander fermenteerders donker sentrums sonder glans ontwikkel. Pienk beteken nie Klebsiella nie, aangesien matige of stadige fermenteerders en sommige organismes wat gewoonlik as niefermenteerders beskou word, pienk of laventelkleurig voorkom. Glans beteken nie definitief E. coli nie, aangesien ander sterk fermenteerders dit ook kan produseer. Die onderrigprotokol en sy beelde van gemengde kulture illustreer elk van hierdie tekortkominge.

Beperkings op bevestiging

EMB-agar toon 'n fenotipe, nie 'n spesie nie. Verskillende organismes kan dieselfde kolonievoorkoms hê, en een organisme kan van sy handboekbeeld afwyk na gelang van stam, ouderdom, digte groei, formulering en inkubasie. Daarom beskou onderrig- en kliniese werkvloeie EMB-morfologie as voorlopig.

'n Verdedigbare werkvloei vir studente is: beskryf die geïsoleerde kolonie (grootte, kleur, sentrum, glans onder skuins invallende lig, slymerige aard), teken die formulering, inkubasietyd en -temperatuur en kontroles aan; subkweek dan 'n goed geïsoleerde kolonie tot 'n suiwer kultuur voordat enige bevestigingstoets gedoen word. Algemene opvolgstappe sluit Gram-kleuring plus IMViC-reaksies vir voorlopige identifikasie van E. coli en koliforme bakterieë in, asook TSI of KIA en organismespesifieke biochemiese toetspanele vir enteriese organismes, met serologiese, MALDI TOF- of ander gevalideerde identifikasie waar die taak dit vereis. Vir agtergrond oor EMB se plek onder selektiewe en differensiële enteriese media, raadpleeg inleidings tot enteriese kultuurmedia en opvolg ná Gram-kleuring. Vir die verwante vraag oor wat 'n blou kleuring op 'n voorwerpglasie kan en nie kan bewys nie, hou die metileenblou-kleuringsatlas waarneming en gevolgtrekking in dieselfde gees apart.

Skryf die waarneming vóór die gevolgtrekking neer. "Donker blouswart kolonies met hoekafhanklike groen glans op Levine EMB ná 24 uur, in ooreenstemming met sterk laktosefermentasie" is verdedigbaar. "E. coli, bevestig" vereis die bevestigingstap wat die plaat alleen nie kan verskaf nie.