Ṣé búlúù mẹ́tílínì lè yí Àkójọpọ̀ III mitochondria ká? Ìdí tí àwọn ìwádìí fi tako ara wọn

Ilé ìwádìí méjì béèrè bóyá búlúù mẹ́tílínì lè yí Àkójọpọ̀ III mitochondria tí a ti dí ká. Ọ̀kan dáhùn pé kò lè ṣe é. Èkejì dáhùn pé ó lè ṣe é. Àwọn méjèèjì ní dátà.

Ìwádìí àkọ́kọ́, lórí mitochondria ọpọlọ eku kékeré, rí i pé àwọ̀ náà kò lè ṣe é. Èkejì, lórí mitochondria ọpọlọ láti ẹ̀yà mẹ́ta ti ẹranko ajẹ́-ẹ̀jẹ̀, rí i pé ó lè ṣe é ní apá kan. Ìwádìí kẹta, lórí ẹ̀dọ̀ eku kékeré, ni a sábà máa ń tọ́ka sí lẹ́gbẹ̀ẹ́ àwọn wọ̀nyí, ṣùgbọ́n ohun mìíràn ni ó dán wò. Bí a bá jẹ́ kí ìwádìí yẹn wà ní ipò tó tọ́ sí i, ìdajì ìdàrúdàpọ̀ náà yóò kúrò.

Kò sí ìlànà iṣẹ́ kan tó kan gbogbo ipò láti kéde. Ìdánwò mẹ́ta ni, pẹ̀lú àwọn olùdènà, ìwọ̀n àti ohun tí a wọn tó yàtọ̀. Ka àwọn ipò ìdánwò náà kọ́kọ́. Àwọn ìparí yóò tẹ̀ lé e.

Ohun tí ọ̀nà àyípo túmọ̀ sí níbí

Àwọn ẹlẹ́kítírónì wọ ẹ̀wọ̀n náà nípasẹ̀ Àkójọpọ̀ I (láti NADH) tàbí Àkójọpọ̀ II (láti succinate), wọ́n kọjá Àkójọpọ̀ III sí cytochrome c, lẹ́yìn náà wọ́n kọjá Àkójọpọ̀ IV sí atẹ́gùn. Ìyàtọ̀ tí a dá sílẹ̀ lẹ́gbẹ̀ẹ́ ọ̀nà náà ni sẹ́ẹ̀lì ń lò láti ṣe ATP.

Ìsọ pé ọ̀nà àyípo wà túmọ̀ sí pé búlúù mẹ́tílínì ń gba àwọn ẹlẹ́kítírónì ṣáájú ibi tí a dí, ó sì ń fi wọ́n sílẹ̀ lẹ́yìn rẹ̀. Àwọ̀ tí ó ti pàdánù ẹlẹ́kítírónì ń gba àwọn ẹlẹ́kítírónì láti NADH tàbí àwọn èròjà ìbẹ̀rẹ̀ ẹ̀wọ̀n náà, ó sì ń di leucomethylene blue; ìrísí tí ó ti gba ẹlẹ́kítírónì náà sì ń fi wọ́n fún cytochrome c tàbí dá wọn padà sínú ẹ̀wọ̀n náà. Bí ìfìfúnni náà bá ṣẹlẹ̀ lẹ́yìn ibi tí a dí, mímí àti agbára iná mànàmáná awo yóò padà ní apá kan. Bí ó bá ṣẹlẹ̀ ní ibi tí a dí tàbí ṣáájú rẹ̀, kò sí ohun tí yóò padà.

Àlàyé kan nípa Àkójọpọ̀ III ló ń pinnu púpọ̀ nínú àríyànjiyàn yìí. Àkójọpọ̀ náà ń ṣiṣẹ́ pẹ̀lú ìyípo Q tó ní ibi ìdènà méjì. Antimycin ń so mọ́ ibi Qi. Myxothiazol ń so mọ́ ibi Qo. Ìwádìí tó lo ọ̀kan ṣoṣo nínú wọn ti dán ìdajì àkójọpọ̀ náà nìkan wò.

Ìwádìí àkọ́kọ́: kò sí ọ̀nà àyípo nínú mitochondria ọpọlọ eku kékeré

Gureev àti àwọn alábàáṣiṣẹ́ rẹ̀ lo mitochondria láti kòtẹ́ẹ̀sì ọpọlọ àwọn eku kékeré C57BL/6, tí a ya sọ́tọ̀ pẹ̀lú digitonin, tí a sì dán wò ní 0.1 mg protein fún ml kan. Àwọn sobusitireti bo ètò mẹ́ta: pyruvate àti malate ní 5 mM ọ̀kọ̀ọ̀kan, succinate ní 10 mM pẹ̀lú glutamate ní 2 mM, àti L-proline ní 10 mM. Àwọn olùdènà ni rotenone ní 1 micromolar (Àkójọpọ̀ I) àti antimycin ní 1 microgram fún ml kan (Àkójọpọ̀ III). Ìwọ̀n àwọ̀ jẹ́ 0.5, 1, àti 2 micromolar, pẹ̀lú 1 micromolar gẹ́gẹ́ bí ìfojúsùn àkọ́kọ́. Àwọn ọ̀nà ìdánwò àti àwọn àkọsílẹ̀ ìwọ̀n wà nínú ìròyìn FEBS Letters.

Ọ̀nà àyípo Àkójọpọ̀ I ṣiṣẹ́. Rotenone dín mímí tí ADP ru sókè kù láti nǹkan bí 121 sí nǹkan bí 2 nmol ní ìṣẹ́jú kan fún mg kan, àwọ̀ ní 1 micromolar sì mú un padà sí nǹkan bí 21. Agbára iná mànàmáná awo padà nígbà lílo pyruvate àti malate, àti nígbà lílo L-proline.

Ọ̀nà àyípo Àkójọpọ̀ III kò ṣiṣẹ́. Antimycin dín mímí kù sí nǹkan bí 16, àwọ̀ sì mú un dé nǹkan bí 20 nìkan. Agbára iná mànàmáná awo kò padà lórí sobusitireti kankan, kódà ní ìwọ̀n àwọ̀ tó dé 5 micromolar. Dátà peroxide tọ́ka sí ohun kan náà: àwọ̀ nìkan mú ìtújáde peroxide pọ̀ sí i láti ìwọ̀n ìpìlẹ̀ tó sún mọ́ 76 pmol ní ìṣẹ́jú kan fún mg kan sí nǹkan bí 1170, 1460, àti 1945 ní àwọn ìwọ̀n mẹ́ta náà, síbẹ̀ antimycin dín àmì tí àwọ̀ náà fa kù ní nǹkan bí 25, 88, àti 96 percent lẹ́sẹẹsẹ. Bí àwọ̀ tí ó ti gba ẹlẹ́kítírónì bá ń fèsì tààrà sí atẹ́gùn, dídí Àkójọpọ̀ III kò yẹ kí ó tẹ àmì náà mọ́lẹ̀. Àwọn òǹkọ̀wé pinnu pé àwọ̀ tí ó ti gba ẹlẹ́kítírónì ń pàdánù wọn ní ibi Qo ti Àkójọpọ̀ III, ṣáájú ibi tí antimycin dí. Ìyípo kúkúrú náà, ní ọ̀rọ̀: àwọn olùfúnni sí àwọ̀, àwọ̀ sí Qo, ọ̀nà déédéé sì tẹ̀ síwájú. A yí rotenone ká. A kò yí antimycin ká.

Ìwádìí kejì: ọ̀nà àyípo ní apá kan nínú ẹ̀yà mẹ́ta, ní ibi ìdènà méjèèjì

Svab àti àwọn alábàáṣiṣẹ́ rẹ̀ fẹ̀ ètò ìdánwò náà sí i. Wọ́n lo mitochondria ọpọlọ láti eku kékeré, eku ńlá, àti eku Guinea, tí a ya sọ́tọ̀ pẹ̀lú Percoll, tí a sì dán wò ní 0.1 mg fún ml kan náà, lórí pyruvate àti malate tàbí glutamate àti malate ní 5 mM ọ̀kọ̀ọ̀kan. Wọ́n lo olùdènà Àkójọpọ̀ III méjì: antimycin A ní 0.3 micromolar àti myxothiazol ní 1 micromolar. Àwọ̀ jẹ́ 2 micromolar nínú ọ̀pọ̀ ìdánwò, àti 0.5 nínú iṣẹ́ cytochrome c. Gbogbo ẹ̀yà mẹ́ta, pẹ̀lú àwọn ìlànà ìdánwò tó bá ara wọn mu, wà nínú àpilẹ̀kọ tí gbogbo ènìyàn lè wọ̀lé sí.

A yí ìdènà méjèèjì ká ní apá kan, nínú gbogbo ẹ̀yà mẹ́ta. Nínú mitochondria eku kékeré, antimycin tẹ mímí mọ́lẹ̀, àwọ̀ sì mú un pọ̀ sí i ní nǹkan bí 60 percent, láti nǹkan bí 37 sí 59 nmol ní ìṣẹ́jú kan fún mg kan. Myxothiazol tẹ̀ ẹ́ mọ́lẹ̀ ní 88 percent, sí nǹkan bí 4.5, àwọ̀ sì mú un pọ̀ sí i ní ìlọ́po márùn-ún sí nǹkan bí 23. Agbára iná mànàmáná awo tún padà ní apá kan lábẹ́ olùdènà èyíkéyìí, tí a wọn pẹ̀lú àwọ̀ méjì (safranin O àti TMRM tí a fi ìpín àwọn ìwọ̀n rẹ̀ ṣe ìṣírò) láti yọ àwọn àmì èké tí ìmọ́lẹ̀ lè fa kúrò.

Àpilẹ̀kọ yìí tún dán ìfìfúnni ẹlẹ́kítírónì náà wò tààrà, ohun tí ìwádìí àkọ́kọ́ kò ṣe rárá. Mitochondria tí ó ní agbára kò fi ẹlẹ́kítírónì kún cytochrome c tí a ti fi acetyl sí, tí a fi kún láti òde ní 25 micromolar, yálà olùdènà wà tàbí kò sí; ṣùgbọ́n fífi àwọ̀ kún un fa fífi ẹlẹ́kítírónì kún un ní ipò méjèèjì. Nínú ojútùú ìdúróṣinṣin pH tí kò ní sẹ́ẹ̀lì, NADH àti àwọ̀ fi ẹlẹ́kítírónì kún cytochrome c ní ìwọ̀n tó bá NADH mu. Fífò gígùn náà, ní ọ̀rọ̀: àwọn orísun agbára fífi ẹlẹ́kítírónì kún sí àwọ̀, àwọ̀ tààrà sí cytochrome c, Àkójọpọ̀ IV sí atẹ́gùn. Ọ̀nà yẹn fo Àkójọpọ̀ III pátápátá, nítorí náà a lè yí olùdènà méjèèjì ká.

Ìwọ̀n àfikún méjì ṣe àtìlẹ́yìn fún ìtumọ̀ yẹn. Ìtànṣán NAD(P)H dín kù nígbà tí a fi àwọ̀ kún mitochondria tí a fi myxothiazol sí, èyí tó túmọ̀ sí pé àwọn orísun agbára fífi ẹlẹ́kítírónì kún ń ṣàn jáde nípasẹ̀ ọ̀nà tuntun náà. Ìfàmọ́ ìmọ́lẹ̀ àwọ̀ ní 660 nm sì tẹ̀ lé ohun kọ̀ọ̀kan tí a fi kún un lẹ́sẹẹsẹ, nígbà tí àwọn omi òkè tí a rí lẹ́yìn yíyí àyẹ̀wò ká fi hàn pé àwọ̀ tí ó ti pàdánù ẹlẹ́kítírónì ń pọ̀ sí i nínú mitochondria tí ó ní agbára ní ohun tó ju ìlọ́po ọgọ́rùn-ún lọ, lẹ́yìn náà ó ń jáde nígbà tí agbára iná mànàmáná awo ṣubú. Ìṣirò àwọn proton náà bá a mu: fífo àwọn ìgbésẹ̀ fífa proton kọjá fi nǹkan bí 2 proton sílẹ̀ fún ẹlẹ́kítírónì méjì dípò 10, nítorí náà lílo atẹ́gùn tó yára sí i pẹ̀lú ìpadà agbára iná mànàmáná awo ní apá kan nìkan ni ohun tí ọ̀nà àyípo gidi máa ń fi hàn, kì í ṣe ẹ̀rí pé kò sí ọ̀nà àyípo.

Àpẹẹrẹ ìdánwò kan náà mú àwọn ìdáhùn jáde tó lè mú ẹni tó kà á láìfọkànbalẹ̀ ṣìnà. Pẹ̀lú olùdènà àti àwọ̀, ADP dín mímí kù dípò kí ó mú un pọ̀ sí i, dídí ìrìnnà sì ru mímí sókè dípò kí ó fa fifalẹ̀ rẹ̀, nígbà tí agbára iná mànàmáná awo ṣì ń yí padà ní àwọn ọ̀nà déédéé. Lílo atẹ́gùn nìkan ń ṣini lọ́nà nínú ètò yìí.

Ìwádìí kẹta: ìwádìí ẹ̀dọ̀ tó dán Àkójọpọ̀ I àti II wò, kì í ṣe III

Lee àti Boelsterli lo mitochondria ẹ̀dọ̀ eku kékeré àti àwọn sẹ́ẹ̀lì ẹ̀dọ̀ tí a tọ́ dàgbà nínú yàrá ìwádìí, tí efavirenz (Àkójọpọ̀ I, IC50 tó sún mọ́ 30 micromolar) àti hydrazine, ohun tí ìyípadà isoniazid nínú ara ń mú jáde (Àkójọpọ̀ II, IC50 tó sún mọ́ 30 micromolar), ti bà jẹ́. Àwọ̀ ní nǹkan bí 30 micromolar mú pípadánù ẹlẹ́kítírónì NADH, agbára iná mànàmáná awo, àti ATP padà, nígbà tí ó dín àwọn ohun tó ń fa pípadánù ẹlẹ́kítírónì àti ikú sẹ́ẹ̀lì nípasẹ̀ necrosis kù. Àpilẹ̀kọ Redox Biology ṣe àwòṣe rẹ̀ bí àwọ̀ tó ń gbé àwọn ẹlẹ́kítírónì yí Àkójọpọ̀ I àti II tí a bà jẹ́ ká.

Àbájáde yẹn jẹ́ àlàyé àyíká tó ti fìdí múlẹ̀ ní apá ìṣáájú ẹ̀wọ̀n, kò sì sọ ohunkóhun nípa Àkójọpọ̀ III nítorí pé kò sí ohun tí a dí níbẹ̀. Kò lè fìdí ìwádìí ọpọlọ èyíkéyìí múlẹ̀ tàbí tako rẹ̀.

Tábìlì àwọn ipò ìdánwò

Ìdí mẹ́rin tí ìwádìí Àkójọpọ̀ III méjèèjì fi lè tọ́ nípa ètò tiwọn

1. Olùdènà náà kì í ṣe ìgbésẹ̀ kan náà. Antimycin nìkan ní 1 microgram fún ml kan ní ìfiwéra pẹ̀lú antimycin ní 0.3 micromolar àti olùdènà ibi Qo mìíràn. Ọ̀nà àwọ̀ tó ń fi ẹlẹ́kítírónì sínú ibi Qo kùnà gan-an ní ibi tí ọ̀nà tààrà sí cytochrome c ti ṣàṣeyọrí. Ibi kan kò lè dúró fún méjèèjì.

2. Ìwọ̀n àwọ̀ àti àkókò yàtọ̀. Ìfojúsùn àkọ́kọ́ ti 1 ní ìfiwéra pẹ̀lú 2 micromolar, nínú ohun tó ń ṣe ìyípo redox, tí bí ó ṣe ń wọlé àti bí ó ṣe ń fi ẹlẹ́kítírónì kún cytochrome c tààrà ṣe sinmi lórí ìfojúsùn àti àkókò. Ìyàtọ̀ kékeré nínú ìwọ̀n pẹ̀lú àkókò ìwọ̀n àbájáde tó yàtọ̀ lè fi àwọn ẹ̀ka tó yàtọ̀ nínú nẹ́tíwọ́ọ̀kì kan hàn.

3. Ìmúrasílẹ̀ àwọn àpẹẹrẹ yàtọ̀. Yíya sọ́tọ̀ pẹ̀lú digitonin ní ìfiwéra pẹ̀lú yíya sọ́tọ̀ nípasẹ̀ ìpele Percoll yan àwọn àkójọ mitochondria tó ní àwọn àjọṣepọ̀ ṣùgbọ́n tí kò jẹ́ ọ̀kan náà pátápátá. Ìfojúsùn protein bá ara rẹ̀ mu ní 0.1 mg fún ml kan, nítorí náà a lè yọ oníyípadà yẹn kúrò, ṣùgbọ́n a kò lè yọ àkójọ kékeré àti bí mitochondria ṣe pé kúrò. A sì yọ ẹ̀yà kúrò lára ohun tí a fura sí: ẹgbẹ́ kejì tún ṣe àfihàn àbájáde rẹ̀ nínú eku kékeré.

4. Ipò sobusitireti ń pinnu ohun tí àwọ̀ lè ṣe. Ètò sobusitireti mẹ́ta ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn méjì-méjì tó sopọ̀ mọ́ NADH. Ìpèsè NADH àti agbára iná mànàmáná awo jọ ń pinnu bí àwọ̀ ṣe ń gba ẹlẹ́kítírónì yára tó àti ibi tí ó ti ń pín sí, ọ̀nà tó sì nílò àwọ̀ tí ó ti gba ẹlẹ́kítírónì lẹ́gbẹ̀ẹ́ cytochrome c tí ó ti pàdánù wọn sinmi lórí yíyan yẹn.

Bí a ṣe lè ka ìsọ ọ̀nà àyípo tó kàn

Béèrè àkójọpọ̀ tí a dí, olùdènà tí a lò, ibi àti ìwọ̀n tí a lò ó. Béèrè ìfojúsùn àwọ̀ àti ìgbà tí a wọn àbájáde. Béèrè àsopọ̀, ẹ̀yà, ọ̀nà yíya sọ́tọ̀, ìfojúsùn protein àti sobusitireti. Sì béèrè bóyá agbára iná mànàmáná awo, mímí, ipò redox àti ìdánwò ìfìfúnni ẹlẹ́kítírónì tààrà bá ara wọn mu, nítorí lílo atẹ́gùn nìkan ti tọ́ka sí ọ̀nà tí kò tọ́ ju ẹ̀ẹ̀kan lọ níbí.

Àkótán tó ní ààlà yìí ṣì dúró. A gbà pé ọ̀nà àyípo àwọ̀ ní àyíká Àkójọpọ̀ I wà. Ní àyíká Àkójọpọ̀ III, mitochondria eku kékeré pẹ̀lú antimycin ní 1 microgram fún ml kan àti àwọ̀ ní 1 micromolar kò fi ọ̀nà àyípo tó ń ṣiṣẹ́ hàn, nígbà tí ẹ̀yà mẹ́ta pẹ̀lú antimycin ní 0.3 micromolar tàbí myxothiazol ní 1 micromolar àti àwọ̀ ní 2 micromolar fi ọ̀nà àyípo ní apá kan hàn, pẹ̀lú ìgbéjáde tààrà láti àwọ̀ sí cytochrome c. Àwọn gbólóhùn wọ̀nyẹn lè jẹ́ òótọ́ papọ̀. Ohunkóhun tó gbòòrò ju èyí lọ jẹ́ fífa ìparí kọjá ẹ̀rí tó wà.

Àwọn àpilẹ̀kọ tó jọmọ́ rẹ̀ jẹ́ kí ìsọ tí a ń jiyàn lórí wà láàárín kẹ́mísírì tí kò sí àríyànjiyàn lórí: bí búlúù mẹ́tílínì ṣe ń gbé àwọn ẹlẹ́kítírónì fún ìgbéjáde láti ọ̀kan sí òmíràn, àwọn ìdánwò ọ̀nà àyípo Àkójọpọ̀ I fún ọ̀ràn apá ìṣáájú ẹ̀wọ̀n tó ti fìdí múlẹ̀, àwọn ìwọ̀n agbára iná mànàmáná awo àti àwọn àmì èké wọn fún ìdí tí àwọ̀ méjì fi ṣe pàtàkì, àti bí a ṣe ń bójú tó àwọn ohun tó ń ṣe ìyípo redox nínú yàrá ìwádìí fún àwọn ìṣòro tó lè wá láti ìwọ̀n àti àkókò.