Àpilẹ̀kọ
Àwọn àṣàyàn mìíràn sí methylene blue fún microscopy: yan gẹ́gẹ́ bí iṣẹ́
Fún smear kokoro arun tó rọrùn, crystal violet lè rọ́pò methylene blue nígbà tí ète náà bá jẹ́ láti rí ìrísí sẹ́ẹ̀lì. Fún àwọn sẹ́ẹ̀lì alààyè, àṣàyàn tó dára jù lè jẹ́ phase contrast láìlo àwọ̀ rárá. Ohun tí o nílò láti ṣàkíyèsí ló ń pinnu àṣàyàn náà.
Ká sọ pé ènìyàn méjì ń ṣàyẹ̀wò bacterial culture kan náà. Ọ̀kan fẹ́ mọ ìyàtọ̀ láàárín àwọn sẹ́ẹ̀lì tó dà bí ọ̀pá àti àwọn sẹ́ẹ̀lì yíyí. Ẹlòmíràn fẹ́ mọ bóyá treatment kan ti pa àwọn kokoro arun náà. Àwọ̀ tó fún ẹni àkọ́kọ́ ní aworan tó ṣe kedere lè má fún ẹni kejì ní ìdáhùn tó lè lò.
Kí o tó yan ohun ìrọ́pò, parí gbólóhùn yìí: “Mo nílò láti ṣàkíyèsí ___ nínú ___, àwọn sẹ́ẹ̀lì sì gbọdọ̀ / kò nílò láti wà láàyè.” Gbólóhùn yẹn ló ń ṣàlàyé iṣẹ́ tí àwọ̀ náà gbọdọ̀ ṣe.
Bẹ̀rẹ̀ pẹ̀lú specimen àti ìbéèrè náà
Kọ́kọ́ pinnu bóyá àwọn sẹ́ẹ̀lì gbọdọ̀ wà láàyè, lẹ́yìn náà mọ ẹya tí o nílò láti ṣàkíyèsí:
- Àwọn sẹ́ẹ̀lì gbọdọ̀ wà láàyè: fún ìrìn tàbí ìrísí, ronú nípa phase contrast láìlo àwọ̀ tàbí DIC; fún nuclear DNA, ronú nípa Hoechst 33342 pẹ̀lú fluorescence; fún membrane integrity, yan assay tí a ti fìdí rẹ̀ múlẹ̀ bíi SYTO 9 pẹ̀lú propidium iodide.
- Àwọn sẹ́ẹ̀lì kò nílò láti wà láàyè: fún bacterial morphology, ronú nípa crystal-violet simple stain tàbí nigrosin negative stain; fún Gram reaction, lo complete Gram-stain method; fún nuclear DNA nínú fixed cells, ronú nípa DAPI fluorescence.
Lo tábìlì yìí láti fi àwọn ààlà ẹ̀ka kọ̀ọ̀kan wé ara wọn. Ìwọ̀nyí jẹ́ àwọn àṣàyàn ọ̀nà, kì í ṣe ìtọ́nisọ́nà láti pààrọ̀ igo nínú protocol tó ti wà.
| Ohun tí o nílò láti ṣàkíyèsí | Specimen àti ohun èlò | Àṣàyàn míì tó ṣeé lò | Ààlà pàtàkì |
|---|---|---|---|
| Ìrísí àti ìtòlẹ́sẹẹsẹ kokoro arun | Prepared bacterial smear; brightfield | Crystal violet simple stain | Ó ń fi morphology hàn; kò fìdí Gram reaction tàbí viability múlẹ̀. |
| Ààlà sẹ́ẹ̀lì lórí abẹ́lẹ̀ dúdú | Bacteriological preparation; brightfield | Nigrosin negative stain | Preparation àti formulation ṣe pàtàkì; sẹ́ẹ̀lì tí kò ní àwọ̀ kì í ṣe pé ó wà láàyè dandan. |
| Gram reaction | Prepared bacterial smear; brightfield | Complete Gram-stain method | Ó nílò gbogbo reagent sequence àti controls. |
| Ìrìn tàbí àwọn ìyípadà nínú sẹ́ẹ̀lì alààyè | Compatible wet preparation; phase contrast tàbí DIC | Kò sí àwọ̀ | Ó nílò optics tó yẹ; contrast kì í dá molecule kan mọ̀. |
| Nuclear DNA | Fixed cells; fluorescence | DAPI | Ó nílò excitation àti emission filters tó bá a mu. |
| Nuclear DNA nínú sẹ́ẹ̀lì alààyè | Live cells; fluorescence | Hoechst 33342 | Wíwọlé sínú sẹ́ẹ̀lì kò fìdí rẹ̀ múlẹ̀ pé àwọn imaging conditions kò ní ipa búburú. |
| Bacterial membrane integrity | Unfixed bacteria; fluorescence | SYTO 9 pẹ̀lú propidium iodide | Membrane staining jẹ́ ìwọ̀n viability tí kò taara. |
Fún simple smear, rọ́pò ọ̀nà náà pẹ̀lú ìṣọ́ra
Crystal violet jẹ́ àṣàyàn tó wúlò nígbà tí iṣẹ́ náà bá jẹ́ wiwo bacterial morphology ní àwọ̀ kan ṣoṣo. Bacteriological Analytical Manual ti FDA ṣe àkójọ formulation crystal violet méjì tó yẹ fún simple staining. Lo formulation tí a ti ṣàkọsílẹ̀ àti ọ̀nà preparation rẹ̀; orúkọ dye nìkan kò ṣàlàyé working reagent kan.
Crystal violet tún wà nínú Gram staining, ṣùgbọ́n ìyẹn kò sọ crystal-violet simple stain di Gram stain. Nínú protocol Gram-stain ti ASM, differential result dá lórí crystal violet, iodine, decolorization, àti counterstaining tí wọ́n ń ṣiṣẹ́ ní títẹ̀lé ara wọn. Tí a bá yọ àwọn ìgbésẹ̀ wọ̀nyẹn kúrò, ohun tí aworan náà lè fìdí múlẹ̀ yóò yí padà. Wo simple staining ní ìfiwéra pẹ̀lú Gram staining fún ìyàtọ̀ yẹn.
Nigrosin ń fúnni ní ọ̀nà mìíràn láti fi ààlà hàn: ó ń sọ abẹ́lẹ̀ di dúdú nígbà tí àwọn bacterial cells bá ṣì fẹ́rẹ̀ẹ́ mọ́lẹ̀. Àlàyé pàtàkì kan wà nínú ìtọ́nisọ́nà nigrosin ti Merck tí àkójọ substitutes gbogbogbò lè má sọ. Formulation iṣẹ́ tí wọ́n sọ pàtó ní formaldehyde nínú. Nítorí náà, o kò lè pinnu pé ó bá live cells mu nítorí ọ̀rọ̀ “negative stain” nìkan, bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn sẹ́ẹ̀lì fúnra wọn dà bí ẹni pé wọn kò ní àwọ̀. Ṣàyẹ̀wò gbogbo formulation àti specimen preparation.
Fún specimens alààyè, ronú nípa yíyí optics padà
Tí o bá fẹ́ wo àwọn sẹ́ẹ̀lì tí wọ́n ń rìn tàbí ń pín, fífi dye mìíràn kún un lè mú observation náà nira síi. Gẹ́gẹ́ bí Nikon ṣe ṣàlàyé nínú ìtọ́sọ́nà rẹ̀ nípa contrast nínú transparent specimens, phase contrast àti differential interference contrast, tàbí DIC, ń jẹ́ kí specimens hàn nípasẹ̀ ìyàtọ̀ nínú optical properties wọn. Wọ́n lè fi àwọn sẹ́ẹ̀lì alààyè tí kò ní àwọ̀ hàn, tí microscope bá ní àwọn component tó yẹ.
Àṣàyàn yìí ń pa preparation tí kò ní àwọ̀ mọ́, ṣùgbọ́n ó ń yí irú ìsọfúnni tó wà padà. O lè tẹ̀lé ààlà kan tàbí ìrìn kan láì mọ molecule wo ló dá contrast náà sílẹ̀. Tí molecular localization bá jẹ́ ìbéèrè náà, yan labeling method tó yẹ dípò rẹ̀.
Fún nuclear DNA, àfiwé DAPI àti Hoechst stains ti Invitrogen ń yà lílo DAPI tó wọ́pọ̀ pẹ̀lú fixed cells sọ́tọ̀ sí Hoechst 33342 tó máa ń wọ sẹ́ẹ̀lì dáadáa jù, tí a sì fẹ́ràn fún live-cell labeling. Méjèèjì nílò fluorescence equipment. Kò sí èyíkéyìí nínú wọn tó jẹ́ ìrọ́pò taara fún colored brightfield stain.
Ka dye exposure àti illumination sí experimental conditions. Fi stained àti unstained preparations wé ara wọn nígbà tí ìwà àwọn sẹ́ẹ̀lì bá jẹ́ ohun tí o ń wọ̀n.
Sẹ́ẹ̀lì pupa kì í túmọ̀ sí sẹ́ẹ̀lì tó kú ní gbogbo ìgbà
A sábà máa ń so SYTO 9 àti propidium iodide pọ̀ láti ṣàyẹ̀wò bacterial membrane integrity. BacLight manual so intact membranes pọ̀ mọ́ green staining, àti damaged membranes pọ̀ mọ́ red staining. Ìtumọ̀ yẹn nílò validation fún specimen náà.
Ìwádìí ọdún 2019 ti Rosenberg àti àwọn ẹlẹgbẹ́ rẹ̀ fi ìṣòro náà hàn. Nínú biofilms E. coli ọlọ́jọ́ 24 lórí gilasi nínú phosphate-buffered saline, ní àyíká 96% ti àwọn sẹ́ẹ̀lì farahàn bí propidium-iodide-positive in situ. Síbẹ̀, àwọn onkọ̀wé fojú díwọ̀n pé 82% lè dàgbà ní culture lẹ́yìn harvesting. Confocal images fi àwọn sẹ́ẹ̀lì tó ní green interiors lábẹ́ red-stained material hàn, èyí tó tọ́ka sí extracellular nucleic acids gẹ́gẹ́ bí ohun tó ń fa signal tó lè ṣìni lọ́nà.
Àwọn percentage wọ̀nyẹn ṣàpèjúwe measurements ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ lórí preparations tí ìwádìí náà lò, kì í ṣe correction factor tó wúlò ní gbogbo ibi. Ẹ̀kọ́ tó wúlò ni láti ṣàyẹ̀wò ohun tó dá signal náà sílẹ̀. Nínú biofilm, nucleic-acid dye lè rí material tó wà níta àwọn sẹ́ẹ̀lì àti material tó wà nínú damaged cells. Fún viability conclusion, àwọn olùwádìí náà ṣeduro complementary measurements, bíi cultivation tàbí metabolic activity, nígbà tí wọ́n tún gba pé ọ̀kọ̀ọ̀kan ní àwọn ààlà tirẹ̀.
Ṣàyẹ̀wò ohun tí àṣàyàn mìíràn ní nínú gan-an
Alternative staining method kan lè ṣì ní methylene blue nínú. Giemsa jẹ́ àpẹẹrẹ: Merck ṣàlàyé product rẹ̀ gẹ́gẹ́ bí azure-eosin-methylene-blue solution, tí a pinnu fún àwọn application tó ní blood àti bone-marrow smears nínú. Ó lè jẹ́ ọ̀nà mìíràn fún specimen mìíràn, ṣùgbọ́n kò bá requirement láti yọ methylene blue kúrò mu.
Tí yíyọ compound kan kúrò bá jẹ́ apá kan ti experiment, ṣàyẹ̀wò reagent identity àti formulation kí o tó fi images wé ara wọn. Ìtọ́sọ́nà sí methyl blue, methylene blue, àti dyes tó ní àwọn orúkọ tó jọra ṣàlàyé àwọn ìyàtọ̀ nínú orúkọ.
Fìdí substitution múlẹ̀ kí o tó lo result náà
Fún ọ̀nà tuntun, ṣe àfiwé kékeré pẹ̀lú representative specimens àti control tó yẹ. Jẹ́ kí microscope settings jọ ara wọn níbi tí ó bá ṣeé ṣe. Ṣàkọsílẹ̀ reagent formulation, specimen preparation, exposure, àti imaging conditions kí aworan tó rí dára jù lè jẹ́ ohun tí a lè ṣèwádìí lórí, dípò kí a kan fẹ́ràn rẹ̀.
Ṣe ìdájọ́ aṣeyọrí gẹ́gẹ́ bí ìbéèrè àkọ́kọ́. Fún morphology, ṣàyẹ̀wò bóyá cell boundaries àti arrangement ṣì ṣeé túmọ̀. Fún nuclear labeling, ṣàyẹ̀wò signal location àti background. Fún viability, béèrè fún ẹ̀rí tó ju color separation tó fani mọ́ra lọ. Ìtọ́sọ́nà tó gbooro sí methylene blue staining àti laboratory applications ṣàlàyé bí observation àti preparation ṣe ń ṣiṣẹ́ pọ̀.
Yan alternative tó ń pa measurement tí o nílò mọ́. Àwọ̀ jẹ́ ọ̀kan ṣoṣo nínú àwọn property ti aworan tó yọrí sí.