מעטילען־בלוי־פּראָבן מיט הייוון: ציילן לעבעדיקע צעלן קעגן מעסטן די צײַט פֿון רעספּיראַציע

צוויי רערלעך שטייען אויפֿן לאַבאָראַטאָריע־טיש. ביידע זענען בלוי. אין איינעם מיינען בלויע צעלן אונטערן מיקראָסקאָפּ טויטן הייוון. אינעם צווייטן מיינט אַ רערל וואָס ווערט פֿון בלוי פֿאַרבלאָז אַז דער הייוון איז לעבעדיק און רעספּירירט. דער זעלבער פֿאַרבשטאָף, פֿאַרקערטע אויסטײַטשונגען. פֿאַרמישט מען די צוויי פּראָבן, קערט זיך יעדער אויספֿיר איבער.

דער אונטערשייד איז דער קערן פֿון דעם גאַנצן אַרטיקל. מעטילען־בלוי איז אַ רעדאָקס־פֿאַרבשטאָף: אָקסידירט איז ער בלוי, רעדוצירט איז ער פֿאַרבלאָזער לעוקאָמעטילען־בלוי. אַ ציילונג פֿון לעבנספֿעיִקייט ניצט די דאָזיקע כעמיע אין אַ קורצן מיקראָסקאָפּישן מאָמענט־בילד. אַ רעספּיראַציע־עקספּערימענט ניצט זי אין אַ צײַט־געמעסטענער רעאַקציע אינעם גאַנצן געמיש. יעדער אופֿן דאַרף זײַן אייגענעם פּראָטאָקאָל, זײַנע אייגענע קאָנטראָלן און זײַן אייגענע סקעפּטישע אָפּשאַצונג.

די ציילונג פֿון לעבנספֿעיִקייט: אַ קורצע פֿאַרבונג, אָפּגעלייענט באַלד

דער פּראָטאָקאָל לויטן ברויערײַ־אופֿן איז די מערסט סטאַנדאַרדיזירטע ווערסיע. צוגרייט 0.01% w/v מעטילען־בלוי אין 2% נאַטריום־ציטראַט, מישט עס 1:1 מיט דער הייוון־סוספּענסיע, און באַטראַכט דאָס געמיש נאָך אַ קורצן, פֿעסט באַשטימטן צײַט־אָפּשניט. פֿאַרעפֿנטלעכטע צײַט־אָפּשניטן גייען פֿון 1 ביז 2 מינוט אין דעם האַנטבוך פֿונעם Brewing Science Institute ביז בערך 5 מינוט אין פֿאָרשונגס־פּראָטאָקאָלן, בעת דער OIV־מעטאָד פֿאַר ווײַן־מיקראָביאָלאָגיע פֿאָדערט אַ באַטראַכטונג אין משך פֿון 10 מינוט. דער פֿאַרבשטאָף אינעם ציילגעמיש קומט צום סוף צו בערך 0.005%. פֿילט אַן פֿאַרבעסערטע Neubauer־קאַמער און קלאַסיפֿיצירט, בײַ בערך 400x, טונקל־בלויע צעלן ווי נישט לעבנספֿעיִק און אומגעפֿאַרבטע צעלן ווי לעבנספֿעיִק. ליכט־בלויע צעלן ווערן גערעכנט ווי לעבעדיק לויטן OIV־מעטאָד, וואָס ווײַזט שוין אָן אויף דעם פּראָבלעם פֿון סוביעקטיוויטעט וואָס ווערט אונטן באַהאַנדלט.

די צעל־קאָנצענטראַציע ווערט באַשטימט לויט דער געאָמעטריע פֿון דער קאַמער. ווען מען ציילט דעם גאַנצן צענטראַלן קוואַדראַט מיט אַ זײַט פֿון 1 mm, איז די צאָל צעלן פּער mL גלײַך צו N מאָל דעם פֿאַרדינונגס־פֿאַקטאָר מאָל 10^4, וווּ N איז די צאָל אין יענעם שטח, ווי באַשריבן אין די ASBC־מעטאָדן פֿאַר הייוון. לעבנספֿעיִקייט איז פּשוטער: אומגעפֿאַרבטע צעלן צעטיילט דורך אַלע צעלן, מאָל 100. ציילט בערך 400 צעלן פֿאַר אַן אָפּשאַצונג פֿון לעבנספֿעיִקייט, לויט דער FEMS־פֿאַרגלײַכונגס־שטודיע אין ברויערײַען און דער OIV־פּראַקטיק. ניצט כּסדר איין גרענעץ־כּלל, למשל אײַנצושליסן צעלן אויף די אונטערשטע און לינקע נעץ־ליניעס און אויסצושליסן די אויף די אויבערשטע און רעכטע.

פֿאַר קנאָספּן דאַרף מען אַ כּלל איידער מען הייבט אָן צו ציילן. אַ פֿאַרשפּרייטער כּלל ציילט אַ קנאָספּ ווי אַ באַזונדערע צעל ווען ער דערגרייכט בערך אַ האַלב פֿון דער גרייס פֿון דער מוטערצעל, און צוזאַמען מיט דער מוטערצעל ווען ער איז קלענער דערפֿון. וועלכן כּלל מען זאָל נישט אויסקלײַבן, ווענדט אים אָן אויף יעדן קוואַדראַט און שרײַבט אים אויפֿן אַרבעטסבלאַט, כּדי דער קומענדיקער מענטש זאָל אים איבערחזרן.

אַרבעטסבלאַט פֿאַרן ציילן (דרוקט דאָס אויס)

דאָס אַרבעטסבלאַט איז אַן אָריגינעלער מאַטעריאַל פֿאַר דעם אַרטיקל. שרײַבט עס איבער אין אַ העפֿט אָדער דרוקט אויס איינס פֿאַר יעדער מוסטער.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, מיט N פֿון דעם באַשטימטן שטח פֿון דער קאַמער. פֿאַרשרײַבט דעם פֿאַרבונגס־צײַט־אָפּשניט לעבן דעם רעזולטאַט, ווײַל אַ צאָל פֿון לעבנספֿעיִקייט אָן איר צײַט־אַנגאַבע קען מען נישט רעפּראָדוצירן.

פֿאַר וואָס די צאָלן פֿון לעבנספֿעיִקייט רוקן זיך

די צײַט איז די ערשטע שטערונג, און זי ווירקט אין ביידע ריכטונגען. מעטאַבאָליש אַקטיווע צעלן רעדוצירן דעם פֿאַרבשטאָף, דערפֿאַר קען אַן פֿריע אָפּלעזונג טרעפֿן לעבעדיקע צעלן איידער זיי פֿאַרענדיקן די רעדוקציע און זיי פֿאַלש קלאַסיפֿיצירן ווי טויט. אָבער אַ פֿאַרלענגערטער קאָנטאַקט איז אַליין טאַקסיש און שאַפֿט טאַקע געשעדיקטע בלויע צעלן, וואָס גיט אַ פֿאַלשע אָנצײַגונג פֿון טויט דורך דער פֿאַרבונג. אַ לאַבאָראַטאָרישער לערן־פּראָטאָקאָל באַשטימט דערפֿאַר אַז מען זאָל אָפּשאַצן אין משך פֿון 5 מינוט, ווי דאָקומענטירט אין אַ Wisconsin־לערן־פּראָטאָקאָל וועגן הייוון. די אָפּגעהיטע פֿאָרמולירונג איז אַז די אָפּשאַצונג מיט מעטילען־בלוי איז צײַט־אָפּהענגיק; באַשטימט דערפֿאַר איין קורצן צײַט־אָפּשניט און האַלט אים גלײַך פֿאַר יעדן מוסטער אין אַ סעריע.

מוסטערן מיט נידעריקער לעבנספֿעיִקייט האָבן אַ צווייטע פֿאַרקרימונג. דער סטאַנדאַרדיזירטער מעטאָד וואָרנט אַז מעטילען־בלוי קען איבערשאַצן די אמתע לעבנספֿעיִקייט אונטער בערך 80%, ווײַל צעלן וואָס קענען נאָך רעדוצירן דעם פֿאַרבשטאָף מוזן נישט האָבן פֿאַרהיט זייער פֿעיִקייט זיך צו פֿאַרמערן. די ברויערײַ־ליטעראַטור באַשרײַבט די זעלבע אומפֿאַרלאָזלעכקייט ווען די לעבנספֿעיִקייט איז שטאַרק פֿאַרקלענערט. באַטראַכט מעטילען־בלוי ווי אַ גיכע, דערנענטערטע אָפּשאַצונג, און באַשטעטיקט קריטישע באַשלוסן בײַ נידעריקער לעבנספֿעיִקייט, ווי למשל ווידער אײַנצוזעצן אַ קולטור אין אַ נײַעם ברו, דורך ציילן קאָלאָניעס אויף פּלאַטעס אָדער דורך אַ דערגאַנצנדיקער פֿאַרבונג.

די ווירקונגען פֿון דער מוסטער־מאַטריץ קומען דריט. דער OIV־מעטאָד ווערט דורכגעפֿירט בײַ בערך pH 4.6 און וואָרנט אַז שטאַרק באַפֿערטע מוסטערן מיט נידעריקן pH פֿאַרהיטן דאָס ריכטיקע אויפֿפֿירן פֿונעם פֿאַרבשטאָף. ער ראָט אויך אָפּ צו נוצן די פּראָבע איבער 100 g/L צוקער, וווּ די צעלן דערשײַנען פֿאַרפֿירעריש ליכט־בלוי. אַן עקספּערימענטעלע פֿאַרגלײַכונג פֿון פֿאַרבונג בײַ פֿאַרשידענע pH־ווערטן האָט געפֿונען שטאַרק געענדערטע סענסיטיוויטעט איבער דעם געפּרוּווטן ראַנג, אין הסכּם מיט אַ שטודיע פֿון אַ pH־אָפּהענגיקן מעטילען־בלוי־מעטאָד. אָפּפֿאַל איז אַ באַזונדערע פּאַסטקע: פֿאַרבטע פּאַרטיקלען אין אומריינע מאַש־געמישן זעען אויס ווי טויטע צעלן און פֿאַרגרעסערן די אונטערשיידן צווישן אָפּעראַטאָרן.

די דאָזיקע וואַריאַביליטעט איז געמעסטן, נישט בלויז באַשריבן אין אַנעקדאָטן. אין אַ זעקס־חדשיםדיקן ברויערײַ־פּרוּוו, באַשריבן אין דער FEMS־פֿאַרגלײַכונג פֿון הייוון־מעטאָדן, האָבן דופּליקאַט־מעסטונגען מיט מעטילען־בלוי געהאַט אַ דורכשניטלעכע סטאַנדאַרט־אָפּווײַכונג פֿון 6.1%, קעגן 0.2% פֿאַר פֿלוס־ציטאָמעטריע מיט אָקסאָנאָל. צוויי אָפּעראַטאָרן האָבן זיך אונטערגעשיידט מיט ביז 13 פּראָצענט־פּונקטן בײַם זעלבן מוסטער. אַ קוואַנטיטאַטיווע פֿאַרגלײַכונג פֿון לעבנספֿעיִקייט־מעטאָדן פֿון 2023 האָט געפֿונען אַז פֿלואָרעסצענץ־מיקראָסקאָפּיע און פֿלוס־ציטאָמעטריע זענען באַדײַטנדיק פּינקטלעכער, און Zugleich געוויזן אַז די רעזולטאַטן זענען אָפּהענגיק פֿון דער מין און דער מאַטריץ. די קלאַסישע מעטאָד־באַשרײַבונג פֿון Painting און Kirsop (PMID 24430080) בלײַבט דער רעפֿערענץ־פּונקט, און אַ ברייטערער איבערבליק פֿון פּראָבן פֿאַר הייוון־לעבנספֿעיִקייט און וויטאַליטעט (PMID 25154541) שטעלט מעטילען־בלוי צווישן דערגאַנצנדיקע, נישט באַשליסנדיקע, פּראָבן. טריפּאַן־בלוי איז דאָ נישט אויטאָמאַטיש אַ פֿאַרבעסערונג: ער ווײַזט אָן אויף דעם פֿאַרלוסט פֿון מעמבראַן־אינטעגריטעט, בעת מעטילען־בלוי ווײַזט אָן אויף אויפֿנעמונג צוזאַמען מיט רעדוצירנדיקער אַקטיוויטעט. דערפֿאַר קענען צעלן אונטער סטרעס ווערן אַנדערש קלאַסיפֿיצירט מיט די צוויי פֿאַרבשטאָפֿן.

דער רעספּיראַציע־עקספּערימענט: מעסט די צײַט ביז דאָס בלוי פֿאַרשווינדט

די צווייטע פּראָבע קוקט קיינמאָל נישט דורך אַ מיקראָסקאָפּ. הייוון מיט גלוקאָז און פֿאַרדינטן מעטילען־בלוי קומט אין אַ פֿאַרמאַכטן רערל, און דער זייגער מעסט ווי לאַנג עס נעמט ביז דאָס בלוי פֿאַרשווינדט. בעת די צעלן פֿירן אויס מעטאַבאָליזם, שאַפֿן זיי רעדוצירנדיקע עקוויוואַלענטן וואָס פֿאַרוואַנדלען דעם בלויען פֿאַרבשטאָף אין זײַן פֿאַרבלאָזער פֿאָרעם, בעת צעלאָזטער זויערשטאָף אָקסידירט אים צוריק. ווען די צעלן פֿאַרקלענערן דעם זויערשטאָף־ניװאָ, נעמט די נעץ־רעדוקציע די אויבערהאַנט און דאָס רערל ווערט ענטפֿאַרבט. דער ענדפּונקט שפּיגלט דערפֿאַר אָפּ דעם באַלאַנס פֿון רעספּיראַציע, פֿאַרבשטאָף־קאָנצענטראַציע און זויערשטאָף־פֿאַרפֿיגבאַרקייט. מען זאָל אים באַריכטן ווי די צײַט פֿון מעטילען־בלוי־רעדוקציע אָדער ענטפֿאַרבונג, נישט ווי אַ דירעקטן קורס פֿון מאָלעקולאַרן זויערשטאָף־פֿאַרנוץ.

ניצט אַ סך מער פֿאַרדינטן פֿאַרבשטאָף ווי בײַ לעבנספֿעיִקייט־אַרבעט, כּדי די געמעסטענע צײַט זאָל אַרײַנפֿאַלן אין אַ באַקוועמען צײַט־ראַם. דער AQA־האַנטבוך פֿאַר די פֿאַרלאַנגטע פּראַקטישע אַרבעטן אויף A level סטאַנדאַרדיזירט דאָס גוט: 1 g גלוקאָז פּער 100 mL וואַסער, דערוואַרעמט צו בערך 30 C, 5 g געטריקנטער הייוון צוגעגעבן גלײַך פֿאַרן באַניץ, און אַן אַרבעטס־לייזונג פֿונעם פֿאַרבשטאָף בײַ בערך 0.001%, צוגעגרייט דורך פֿאַרדינען 0.1 mL פֿון אַ 1% שטאַם־לייזונג ביז 100 mL. מישט 2 mL הייוון־גלוקאָז־סוספּענסיע מיט 2 mL אַרבעטס־לייזונג פֿונעם פֿאַרבשטאָף, לאָזט עס דערגרייכן די פּראָבע־טעמפּעראַטור, שאָקלט איינמאָל פֿאַר 10 סעקונדעס, הייבט אָן די צײַט־מעסטונג און שאָקלט נישט ווידער. שאָקלען ברענגט ווידער אַרײַן זויערשטאָף און מאַכט דאָס רערל ווידער בלוי; דאָס איז דער גרעסטער פּראָצעדורעלער אַרטעפֿאַקט. AQA באַמערקט אַז די צוגרייטונג זאָל געוויינטלעך ווערן ענטפֿאַרבט אין בערך 5 מינוט בײַ 35 C, מיט דורכשניטן אין פּרוּוון פֿון 275 s בײַ 20 C, 128 s בײַ 35 C און 145 s בײַ 45 C. דאָס זענען בײַשפּילן פֿון איין עקספּערימענטעלער צוגרייטונג, נישט אַלגעמיינע פֿאַרגלײַכונגס־נאָרמעס. די קוואַנטיטאַטיווע פֿאַרבינדונג צווישן דעם רעדוקציע־קורס און מעטאַבאָליש אַקטיוון הייוון אונטער קאָנטראָלירטע באַדינגונגען ווערט געשטיצט דורך ספּעציפֿישע רעדוקציע־שטודיעס, אַרײַנגערעכנט די אַרבעט אינדעקסירט ווי PMID 25773544 און די שטודיע פֿונעם מעכאַניזם אין Yeast (2014).

דעמאָנסטראַציע פֿון צײַט־פֿאַרלויף (אָריגינעלער מאַטעריאַל)

די טאַבעלע אונטן איז אַן אָריגינעלע דעמאָנסטראַציע געשאַפֿן פֿאַר דעם אַרטיקל מיט דער אויבן באַשריבענער צוגרייטונג לויטן AQA־אופֿן: 2 mL הייוון־גלוקאָז־געמיש מיט 2 mL אַרבעטס־לייזונג פֿונעם פֿאַרבשטאָף בײַ בערך 0.001%, איין שאָקלונג פֿון 10 סעקונדעס, דערנאָך אַן אומגעשטערטע אינקובאַציע. די אײַנטראָגן זענען בײַשפּיל־אָפּלעזונגען אינעם פֿאָרמאַט וואָס אַ סטודענטן־גרופּע זאָל פֿאַרשרײַבן, מיטן קורס־אינדעקס דעפֿינירט ווי 1 צעטיילט דורך דער ענטפֿאַרבונגס־צײַט אין סעקונדעס. פֿירט דורך דעם פּרוּוו מיט די זעלבע רערלעך און פֿאַרבײַט די אײַנטראָגן מיט געמעסטענע ווערטן.

צייכנט דעם קורס־אינדעקס קעגן דער טעמפּעראַטור פֿאַר רערלעך A, B און C. די קורווע שטײַגט און ווערט דערנאָך פֿלאַך אָדער פֿאַלט, וואָס איז דער דערוואַרטער מוסטער געטריבן דורך ענזימען, נישט אַ גלײַכע ליניע. רערלעך D, E און F זענען נישט קיין דאַטן־פּונקטן אויף יענער קורווע. זיי זענען די קאָנטראָלן וואָס דערמעגלעכן צו פֿאַרשטיין די קורווע.

קאָנטראָלן וואָס געבן יעדער פּראָבע אַ באַדײַט

יעדער רעספּיראַציע־פּרוּוו דאַרף דרײַ באַגלייטערס. געקאָכטער אָדער געטויטער הייוון מיט גלוקאָז און פֿאַרבשטאָף זאָל בלײַבן בלוי, און אַזוי באַווײַזן אַז גיכע רעדוקציע איז אָפּהענגיק פֿון לעבעדיקן מעטאַבאָליזם. לעבעדיקער הייוון מיט פֿאַרבשטאָף אָן צוגעגעבענעם גלוקאָז איז אַ סובסטראַט־קאָנטראָל, אָבער דערוואַרט סײַ־ווי אַ פּאַמעלעכע ענטפֿאַרבונג, ווײַל הייוון פֿאַרניצט אינערלעכע רעזערוון. גלוקאָז מיט פֿאַרבשטאָף אָן הייוון איז דער כעמישער בלאַנק, וואָס איז נייטיק ווײַל גלוקאָז אין אַלקאַלישע באַדינגונגען קען רעדוצירן מעטילען־בלוי אָן קיין צעלן.

בײַם ציילן לעבנספֿעיִקייט דאַרף מען אַן אַנדער סאָרט קאָנטראָל: פּראָצעדורעלע קאָנסטאַנץ. די זעלבע שטאַם־לייזונג פֿונעם פֿאַרבשטאָף, די זעלבע מיש־פּראָפּאָרציע, דער זעלבער פֿאַרבונגס־צײַט־אָפּשניט, דער זעלבער קאַמער־שטח, די זעלבע קנאָספּ־ און גרענעץ־כּללים, און אַ בלינדע ציילונג וווּ עס איז מעגלעך. ווען צוויי אָפּעראַטאָרן זענען נישט מסכּים מיט צען פּונקטן, ווײַזט דאָס אַרבעטסבלאַט געוויינטלעך די סיבה: אַנדערע צײַטן, אַן אַנדער שוועל פֿאַר בלוי אָדער אַנדערע קנאָספּ־כּללים. די טעכניקן פֿאַר צוגרייטן און באַטראַכטן פֿאַרבטע צעלן זענען פֿאַרבונדן מיט מעטאָדן פֿון פּשוטער באַקטעריע־פֿאַרבונג, בעת אַ ברייטערער איבערבליק פֿון וואָס דער פֿאַרבשטאָף מאַרקירט אין פֿאַרשידענע מוסטערן געפֿינט זיך אינעם אַטלאַס פֿון מיקראָסקאָפּישער פֿאַרבונג. וועגן דער פֿיזיק הינטער דער קוואַנטיטאַטיווער אָפּלעזונג פֿון יעדער בלויער אינטענסיטעט דערקלערט די אַבזאָרפּציע־רעפֿערענץ מיט אָנגעגעבענע באַדינגונגען פֿאַר וואָס יעדער קאָעפֿיציענט מוז באַגלייט ווערן מיט זײַן לייזמיטל, pH און קאָנצענטראַציע־באַדינגונגען.

קלײַבט די פּראָבע לויט דער פֿראַגע. וויפֿל צעלן זענען לעבעדיק איצט איז אַ צייל־פֿראַגע, וואָס מען באַענטפֿערט בײַם מיקראָסקאָפּ מיט אַן אַרבעטסבלאַט. ווי אַקטיוו רעספּירירט די דאָזיקע קולטור איז אַ קינעטישע פֿראַגע, וואָס מען באַענטפֿערט מיט אַ סטאָפּזייגער און קאָנטראָלירטע רערלעך. מעטילען־בלוי דינט ביידן, אָבער קיינמאָל נישט אינעם זעלבן רערל אין דער זעלבער צײַט.