Maqola
G6PD laboratoriya testlarida metilen ko‘ki: bo‘yoq aslida nima qiladi
Talaba inkubatsiyadan so‘ng ikkita probirkani kuzatadi. Biridagi rang kutilganidek o‘zgargan. Ikkinchisida esa o‘zgarmagan. Talaba ikkinchi bemorda glyukoza-6-fosfat degidrogenaza yetishmovchiligi bor, degan xulosaga keladi. Bu xulosa to‘g‘ri bo‘lishi mumkin, ammo bunday mulohazada testning ishlashini ta’minlaydigan asosiy tushuncha chetda qoladi. Probirkada fermentning o‘zi bevosita o‘lchanmaydi. Unda metilen ko‘ki vositachi sifatida ishlatilib, ferment hosil qiladigan mahsulot o‘lchanadi.
Bu bilvosita mexanizm tushunilgach, bajarish tartibi, nazorat namunalari va noto‘g‘ri natijalarning uzun ro‘yxati endi tasodifiydek ko‘rinmaydi.
Qisqa javob
G6PD testida metilen ko‘ki oksidlanish-qaytarilish indikatoridir. G6PD fermenti NADPH hosil qiladi, NADPHga bog‘liq tizimlar esa ko‘k rangli metilen ko‘kini uning rangsiz leyko shakliga qaytaradi yoki undan elektronlarni tashish uchun foydalanadi. Fermentning normal faolligi samarali qaytarilishni ta’minlaydi. Faollik yetishmasa, qaytarilish sekin yoki chala kechadi. Testning butun signali shundan iborat.
Ikki tarixiy usulda bir xil bo‘yoq ishlatiladi, ammo yakuniy ko‘rsatkichlari farq qiladi. Ularni bir-biridan ajratsangiz, chalkashliklarning aksariyati yo‘qoladi.
Ikki test, bitta bo‘yoq, turli yakuniy ko‘rsatkichlar
Birinchisi — Sass va hamkasblari ta’riflagan, keyinchalik Gibbs baholagan metilen ko‘kini bevosita qaytarish testi. Bunda yakuniy ko‘rsatkich bo‘yoqning o‘zidir: oksidlangan, ko‘k rangli metilen ko‘ki rangsiz leykometilen ko‘kiga aylanish tomon qaytariladi va bu o‘zgarish tezligi NADPH hosil qilish qobiliyatini aks ettiradi. Skriningga oid dastlabki maqola PubMed bazasida Sass va boshqalar (1966) nomi bilan indekslangan.
Ikkinchisi — Brewer metgemoglobinni qaytarish testi. Avval natriy nitrit gemoglobinni jigarrang metgemoglobinga oksidlaydi. Keyin metilen ko‘ki elektron tashish vositachisi sifatida ishlaydi: qaytarilgan metilen ko‘ki qaytaruvchi ekvivalentlarni metgemoglobinga uzatib, uni yana qizil gemoglobinga aylantiradi. Demak, ko‘zga ko‘rinadigan yakuniy ko‘rsatkich ko‘k va rangsiz holat o‘rtasidagi emas, jigarrang va qizil holat o‘rtasidagi farqdir. Dastlabki usul Jahon sog‘liqni saqlash tashkiloti byulletenida (Brewer va boshqalar, 1960) e’lon qilingan.
Brewer tahlilini bo‘yoqni rangsizlantirish testi deb atash kimyoviy jihatdan aniq emas. Bo‘yoq siklik ravishda o‘zgaradi; rangini esa gemoglobin o‘zgartiradi. Quyidagi diagrammada ikkala yo‘l ham ko‘rsatilgan.
Asosiy reaksiya
G6PD pentozafosfat yo‘lining birinchi oksidlanish bosqichini katalizlaydi:
Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
Yetilgan eritrotsitlar NADPH olish uchun ushbu yo‘lga katta darajada bog‘liq. Bu Luzzatto va hamkasblarining Blood jurnalidagi sharhida (2020) ko‘rib chiqilgan. NADPH glutationni qaytarilgan holatda saqlaydi va hujayrani oksidlovchi shikastlanishdan himoya qiladi. Metilen ko‘ki bu tizimga elektron qabul qiluvchi sifatida qo‘shiladi. G6PD yetarli bo‘lsa, NADPH ham yetarli bo‘ladi va qaytarilish samarali kechadi. G6PD kamligi bu zanjirni birinchi bo‘g‘inidayoq uzadi.
Bo‘yoqni dvigatel emas, yonilg‘i darajasini ko‘rsatuvchi asbob deb tasavvur qiling. U NADPH ta’minoti haqida ma’lumot beradi. Ushbu ta’minotni yoki natijaning o‘qilishini o‘zgartiradigan boshqa har qanday omil genda hech qanday o‘zgarish bo‘lmasa ham ko‘rsatkichni siljitishi mumkin.
Brewer turidagi test qanday bajariladi
Reagent tarkiblari o‘n yilliklar davomida o‘zgarib kelgan, shuning uchun o‘quv maqsadidagi tavsifni klinik protokol deb qabul qilmaslik kerak. Har bir laboratoriya o‘zining validatsiyadan o‘tgan standart ish tartibiga amal qiladi. Shu ogohlantirishni hisobga olgan holda, klassik probirka usuli quyidagicha bajariladi; uchta probirka va 3 soatlik inkubatsiya qo‘llangan shakli ushbu e’lon qilingan amaliyotda hujjatlashtirilgan:
- Bemor probirkasi: yaxlit qon, glyukoza, natriy nitrit va metilen ko‘ki. Nitrit metgemoglobin hosil qiladi, glyukoza eritrotsitlar metabolizmini ta’minlaydi, bo‘yoq esa NADPHga bog‘liq elektron tashuvchisi vazifasini bajaradi.
- Oksidlangan nazorat namunasi: qon, nitrit va glyukoza, ammo metilen ko‘kisiz. U yetishmovchilikka xos jigarrang metgemoglobin yakuniy rangini ko‘rsatadi.
- Gemoglobin nazorat namunasi: qon va suv. U normal holatga xos qizil gemoglobin yakuniy rangini ko‘rsatadi.
- Barcha probirkalarni taxminan 37 C da, odatda 3 soat davomida, ohista aralashtirib inkubatsiya qiling.
- Hujayralarni lizisga uchratish va ranglarni solishtirishni osonlashtirish uchun har bir probirkadan olingan kichik alikvotani distillangan suvda suyultiring.
- Bemor probirkasini ikkita nazorat namunasi bilan solishtiring. Rangning qizil tomonga qaytishi sezilarli qaytarish qobiliyatini bildiradi. Jigarrang bo‘lib qolishi esa yaqqol yetishmovchilikni taxmin qilishga asos beradi.
Tarixiy tarkiblardan birida taxminan 1 mL qon va konsentratsiyasi taxminan 180 mM natriy nitrit, 280 mM dekstroza hamda 0.4 mM metilen ko‘ki bo‘lgan reagentlar ishlatilgan. Bu sonlarni universal talab emas, adabiyotdan olingan misol sifatida qabul qiling.
Natijani talqin qilish
| Holat | Brewer testidagi ko‘rinish | Ma’nosi |
|---|---|---|
| Normal | Bemor probirkasi qizil gemoglobin nazorat namunasiga yaqinlashadi | Qaytarish qobiliyati skrining chegarasidan yuqori |
| Yetishmovchilik | Bemor probirkasi jigarrangligicha qolib, metgemoglobin nazorat namunasiga yaqin bo‘ladi | Skrining yaqqol G6PD yetishmovchiligini taxmin qilishga asos beradi |
| Oraliq | Rang nazorat namunalari orasida bo‘ladi | Fenotip belgilamang; faollikni miqdoriy o‘lchang |
Sifat skriningi normal faollikning taxminan 30 dan 40 foizigacha bo‘lgan chegarasi atrofida holatlarni eng yaxshi farqlaydi. Bu Malaria Journal jurnalining G6PDni aniqlashdagi bo‘shliqlar haqidagi sharhida muhokama qilingan. Shuning uchun normal skrining natijasi tahlil og‘ir yetishmovchilikni aniqlamaganini anglatadi. U faollik to‘liq normal ekanini tasdiqlamaydi.
Nega skrining chalg‘itadi
Gemolizdan keyingi retikulotsitoz — soxta normal natijaning klassik sababidir. Yosh eritrotsitlar va retikulotsitlarda eski hujayralarga qaraganda ko‘proq G6PD bo‘ladi. O‘tkir gemoliz epizodida eng eski va fermenti eng kam hujayralar allaqachon yemirilgan bo‘lishi mumkin. Natijada faolligi tekshirilganda normal chiqadigan yosh hujayralar populyatsiyasi qoladi. Shu biologik holat faqat bo‘yoqli skrininglarni emas, miqdoriy tahlillarni ham chalg‘itadi.
Yaqinda qon quyilgani yetishmovchilikni yashiradi, chunki donor eritrotsitlari namunaga o‘z fermentini qo‘shadi. Mayo Clinic Laboratories qon quyishni retikulotsitoz va leykotsitlar ta’siri bilan bir qatorda, ferment tahlili natijalarining ishonchsiz bo‘lishiga sabab bo‘ladigan omillardan biri sifatida ko‘rsatadi.
Geterozigot ayollar eng murakkab holatdir. X-xromosomaning tasodifiy inaktivatsiyasi normal va ferment yetishmovchiligi bo‘lgan eritrotsitlar aralashmasini hosil qiladi. Umumiy faollik esa og‘ir yetishmovchilikdan tortib, tashqi ko‘rinishda normal holatgacha bo‘lgan istalgan darajada chiqishi mumkin. Sifat skrininglari oraliq fenotiplarni ko‘pincha aniqlamaydi. WHOning G6PD testiga oid hujjatlarida bu cheklov batafsil muhokama qilingan.
Namunaning yoshi, saqlash harorati, yakuniy rangni ko‘z bilan baholashning subyektivligi, gematokrit va reagent sifati ushbu biologik ta’sirlarga qo‘shimcha analitik xatolik kiritadi.
Skrining tashxis emas
Yetishmovchilikni ko‘rsatuvchi, oraliq yoki klinik holatga mos kelmaydigan skrining natijasi G6PD fermenti faolligining miqdoriy tahlilini talab qiladi. WHO harorat nazorat qilinadigan miqdoriy spektrofotometriyani etalon usul deb hisoblaydi. Bu tahlilda eritrotsitlar gemolizatiga glyukoza-6-fosfat va NADP+ qo‘shiladi, hosil bo‘lgan NADPH esa 340 nm da yorug‘lik yutilishining ortishi orqali kuzatiladi. O‘zgarish tezligi ferment faolligiga mutanosib bo‘lib, odatda gemoglobinning har bir grammiga to‘g‘ri keladigan birliklarda ifodalanadi. Hozirgi klinik-laboratoriya amaliyoti Mayo testlar katalogining G6PD faolligiga oid bo‘limida umumlashtirilgan.
Talqinda laboratoriya validatsiyadan o‘tkazgan referens oraliq qo‘llanadi; u ko‘pincha populyatsiyadagi normal faollikka nisbatan ifodalanadi. Yetishmovchilik odatda 30 foizlik chegara atrofida, oraliq faollik esa undan yuqorida muhokama qilinadi. WHOning G6PD testlari uchun maqsadli mahsulot profillarida (2022) ushbu diagnostik asos bayon qilingan. Agar yaqinda yuz bergan gemoliz yoki qon quyish fenotipni aniqlashni ishonchsiz qilsa, eritrotsitlar populyatsiyasi qayta muvozanatlashgach test takrorlanadi. Molekulyar tekshiruv esa ferment o‘lchovining o‘rnini bosmasdan qo‘shimcha ma’lumot berishi mumkin.
Saqlashga arziydigan farq
Bu tahlillarda metilen ko‘ki ex vivo laboratoriya reagenti hisoblanadi. Bu masala metilen ko‘kini bemorga berish xavfsizligidan alohida muhokama qilinishi kerak. Xavfsizlik masalasi metilen ko‘kiga qarshi ko‘rsatmalar bo‘yicha qo‘llanmada yoritilgan. Ularni biokimyo bog‘laydi, chunki preparat ham NADPHga bog‘liq qaytarilishga tayanadi. Ammo probirkadagi bo‘yoq qon oqimidagi doza emas. Bo‘yoq boshqa sharoitda bo‘yash vositasi sifatida qanday ishlashini tushunish uchun metilen ko‘ki bilan bo‘yash tamoyillariga, u mansub bo‘lgan kimyoviy guruh haqida esa laboratoriyadagi oksidlanish-qaytarilish bo‘yoqlariga qarang.
Skrining qaytarish qobiliyati saqlangan ko‘rinadimi, degan savolga javob izlaydi. Tasdiqlovchi tekshiruv esa aslida qancha ferment borligini aniqlaydi. Bo‘yoqdan ikkinchi savolga javob berish talab qilinmasa, u birinchi savol uchun yaxshi xizmat qiladi.