DNK va RNKni bo‘yash uchun metilen ko‘ki: gellar va membranalarda qo‘llanishi

Talaba agaroza gelida elektroforez o‘tkazadi, uni metilen ko‘ki bilan bo‘yaydi va yorqin tasma kutilgan joyda hech narsa ko‘rmaydi. Qo‘shni ish joyida postdoktorant o‘sha ko‘k eritma shishasidan foydalanib Northern membranasini bo‘yaydi va uch daqiqada aniq ribosomal tasmalarni oladi. Talaba gel tajribasi muvaffaqiyatsiz bo‘lgan degan xulosaga keladi. Ammo gel tajribasi muvaffaqiyatsiz bo‘lmagan. Ikki vazifa turlicha edi va bir xil bo‘yoq ularga turli sezgirlik, turli fon hamda keyingi amallar uchun turli qoidalar bilan javob beradi.

Metilen ko‘ki bilan DNKni bo‘yash va metilen ko‘ki bilan RNKni bo‘yashning kimyosi bir xil, ammo maqsadi boshqa. Gelda bo‘yoq g‘ovak matritsa ichida qancha nuklein kislota borligini ko‘rsatadi. Membranada esa ko‘chirish muvaffaqiyatli bo‘lganini va yo‘laklarga namuna bir tekis yuklanganini ko‘rsatadi. Bu farq tushunarli bo‘lgach, protokollar, aniqlash chegaralari va moslik cheklovlari ham o‘z o‘rniga tushadi.

Qisqa javob

Metilen ko‘ki yassi tuzilishga ega kationli bo‘yoq bo‘lib, nuklein kislotalar bilan nokovalent va qaytar tarzda bog‘lanadi. Bunda fosfatga elektrostatik tortilish, asos juftlari orasiga interkalatsiya va kichik egat bilan bog‘lanish birgalikda qatnashadi. Aynan shu qaytarlik muhim. Tasmalarni bo‘yash, ko‘rinadigan yorug‘likda qayd etish, so‘ng klonlash, gibridizatsiya yoki zond bilan qayta tekshirish uchun rangsizlantirish yoki tozalash mumkin.

Ikki zanjirli DNKni agaroza gelida metilen ko‘ki bilan bo‘yashning standart tezkor retsepti — suvdagi 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) eritma, taxminan 15 daqiqa bo‘yash va taxminan 15 daqiqa suvda rangsizlantirish; natija oq yorug‘likli yoritgichda ko‘riladi. Membranalar uchun klassik Northern blot retsepti pH 5.2 atrofidagi natriy asetat eritmasida 0.02 dan 0.04 percent gacha bo‘yoqni nazarda tutadi: ko‘chirish va immobilizatsiyadan keyin bir necha daqiqa bo‘yash, so‘ng suvda chayish va gibridizatsiyadan oldin to‘liq rangsizlantirish. Sezgirlik uncha yuqori emas: yaxshi sharoitlarda har bir gel tasmasi uchun o‘nlab yoki yuzlab nanogramm; ehtiyotkor qo‘llanmalarda esa 0.5 dan 1 microgram gacha ko‘rsatiladi. Bu etidiy bromid va SYBR bo‘yoqlariga qaraganda bir necha tartib yuqori miqdordir. Membranalarda bitta transkript uchun foydali aniqlash chegarasi yo‘q, chunki bo‘yoq asosan ko‘p miqdordagi ribosomal RNKni va yuklangan umumiy materialni ko‘rsatadi. Bu retseptlarning hech birida chakana sotiladigan qo‘shimcha mahsulot eritmasini o‘rinbosar sifatida ishlatmang. Tasdiqlangan usullar analitik tozalikdagi bo‘yoq, tarkibi aniq buferlar va RNK bilan ishlaganda RNazasiz sharoitni nazarda tutadi.

Bog‘lanish qanday kechadi va qayerda chalg‘itadi

Foydali model uch qismdan iborat. Birinchidan, musbat zaryadlangan halqalar tizimi manfiy zaryadlangan fosfat skeletiga tortiladi. Spektroskopik tadqiqotlarda tuz miqdori past bo‘lganda ushbu elektrostatik omil ustun ekani aniqlangan; modellashtirish va molekulyar dinamika esa ikki zanjirli DNK uchun interkalatsiya va kichik egatga bog‘lanishni barqaror usullar sifatida ko‘rsatadi. Bu metilen ko‘kining DNK bilan bog‘lanishini spektroskopik o‘rganish maqolasida umumlashtirilgan. Ikkinchidan, GCga ma’lum moyillik mavjud: modellashtirish CpG va GpC bosqichlarini afzal ko‘rsatadi, tajribalar esa metilen ko‘kining interkalatsiya moyilliklari haqidagi ishda GCga boy duplekslar bilan ustun bog‘lanishni qayd etgan. Biroq AT duplekslari ham bog‘lanadi. Odatiy bo‘yash muayyan ketma-ketlikka xos emas. Uchinchidan, bir zanjirli DNK va RNK asosan elektrostatik ta’sirlar hamda ochiq asoslar va dupleks sohalar bilan steking orqali bog‘lanadi. Shu sababli bo‘yash kuchi uzunlik, ketma-ketlik va ikkilamchi tuzilishga qarab o‘zgaradi.

Bundan ikki oqibat kelib chiqadi. Bog‘lanish nokovalent bo‘lgani uchun bo‘yoq yuvilib chiqadi. Poliakrilamid tasmalar ataylab fiksatsiya qilinmasa, tez xiralashadi. Oddiy bo‘yash vaqtinchalik bo‘lgani sababli maxsus doimiy fiksatsiya varianti ishlab chiqilgan; u Soto va Draperning PAGE gellari haqidagi ishida tasvirlangan. Bo‘yoq fotosensibilizator bo‘lgani uchun kislorod ishtirokida bo‘yalgan DNKni uzoq vaqt kuchli yoritish guaninni oksidlashi va oxir-oqibat zanjirlarda bir zanjirli uzilishlar hosil qilishi mumkin. Bu mexanizm metilen ko‘ki vositasida fotosensibilizatsiyalangan guanin oksidlanishi haqidagi ishda batafsil yoritilgan. Oq yorug‘likda qisqa kuzatish klassik etidiy bromid ish jarayonlaridagi yaxshi ma’lum UV shikastlanishidan saqlaydi va bu preparativ ajratib olish uchun haqiqiy afzallikdir. Ko‘rinadigan yorug‘lik yumshoqroq ta’sir qiladi, ammo zararsiz emas. DNK klonlanadigan bo‘lsa, yoritish vaqtini qisqa tuting. Bu ehtiyot chorasining kengroq fotokimyoviy asoslari uchun metilen ko‘ki fotokimyosidagi ikki yo‘l maqolasiga qarang. Oksidlangan shakl nima uchun bog‘lanishi, qaytarilgan shakl esa nima uchun bog‘lanmasligini tushuntiruvchi oksidlanish-qaytarilish jufti va zaryad holatlari haqida metilen ko‘kining tuzilishi va xossalari kimyosi maqolasiga qarang.

Birinchi vazifa: gellar ichida bo‘yash

Gelni bo‘yash bitta savolga javob beradi: ushbu tasmada ko‘z bilan ko‘rish uchun yetarli nuklein kislota bormi? Agaroza ichidagi ikki zanjirli DNK eng yaxshi o‘rganilgan holatdir. Flores va hamkasblarining dastlabki metilen ko‘ki bilan gel bo‘yash usuli 1 percent agarozada 0.02 percent tezkor protokolni tasdiqlagan va keyinchalik DNKni muvaffaqiyatli ajratib olish hamda klonlashni ko‘rsatgan. Xuddi shu yetkazib beruvchi protokoli IBI Scientific metilen ko‘ki mahsuloti sahifasida ham berilgan; unda 0.04 percent membrana retsepti va tezkor gel varianti yonma-yon keltirilgan.

Amaliy ish jarayoni:

1. Gel elektroforezini odatdagidek o‘tkazing. O‘zgartirilgan usul uchun ko‘chirish yoki ajratish aniqligi tasdiqlanmagan bo‘lsa, elektroforez vaqtida emas, undan keyin bo‘yang.
2. Gelni distillangan suvdagi 0.02 percent w/v metilen ko‘ki eritmasiga solib, sekin chayqatgan holda taxminan 15 daqiqa saqlang.
3. Suvni bir necha marta almashtirib, jami taxminan 15 daqiqa rangsizlantiring; matritsa foni pasayib, tasmalar ajralib ko‘rinishi kerak.
4. Oq yorug‘likli yoritgichda darhol suratga oling.

Agaroza va poliakrilamid turlicha xususiyat ko‘rsatadi. Agaroza matritsasida bo‘yoq saqlanib qoladi, shu sababli rangsizlantirish sekin bosqichdir. Yupqa poliakrilamid gellari tez bo‘yaladi, lekin bo‘yoqni ham tez yo‘qotadi. Bu preparativ kesib olish uchun qulay, ammo arxiv qaydlarini saqlashga xalaqit beradi. Poliakrilamiddagi sintetik oligonukleotidlarni amalda shakllangan Current Protocols uslubidagi PAGE usullariga amal qilib, xuddi shu 0.02 percent retsept bilan, suvda takroran yuvish orqali 20 dan 30 daqiqagacha vaqt ichida topish mumkin. Preparativ oligonukleotidlar uchun suyultirilgan TBEda taxminan 0.0002 percent bo‘lgan juda suyultirilgan variantlar bir necha soat davomida qo‘llangani haqida xabarlar bor, ammo buning daliliy bazasi kuchsizroq.

DNK va RNK o‘rtasidagi farq muhim. Ikki zanjirli DNK eng kuchli tuzilishga bog‘liq bog‘lanishni beradi. RNK va bir zanjirli DNK ham bo‘yaladi, ammo kuchsizroq va natijasi kamroq bashorat qilinadi. Formaldegidli agaroza RNK gellari bilan ishlaydigan ko‘pchilik laboratoriyalar gel ichida ko‘k bo‘yoq bilan bo‘yashni o‘tkazib yuboradi: avval RNKni membranaga ko‘chiradi, keyin o‘sha yerda bo‘yaydi. Bu o‘zgarish kuchsiz gel signalining o‘rniga aniqroq membrana signalini va yuklash qaydini beradi.

Ikkinchi vazifa: membranalarda bo‘yash

Membranani bo‘yash boshqa savolga javob beradi: ko‘chirish muvaffaqiyatli bo‘ldimi va yo‘laklarni o‘zaro taqqoslash mumkinmi? Klassik qo‘llanish — Herrin va Schmidtning qaytar Northern blot bo‘yashi. Dastlab pH 5.0 da 50 mM natriy asetatdagi 0.04 percent bo‘yoq bilan 2 dan 3 daqiqagacha bo‘yash va suvda chayish qo‘llangan; bo‘yoqni gibridizatsiyadan oldin SSPEdagi suyultirilgan SDS bilan olib tashlash mumkin bo‘lgan.

Keng qo‘llanadigan zamonaviy variant quyidagicha:

1. RNK yoki denaturatsiyalangan DNKni neylon yoki nitrosellyulozaga ko‘chiring, so‘ng bo‘yash vaqtida namuna yo‘qolmasligi uchun UV bilan ko‘ndalang bog‘lash yoki qizdirish orqali immobilizatsiya qiling.
2. Ixtiyoriy, ammo keng tarqalgan qadam: membranani 5 percent sirka kislotasida taxminan 15 daqiqa ho‘llang.
3. pH 5.2 atrofida 0.3 dan 0.5 M gacha natriy asetatdagi 0.02 dan 0.04 percent gacha metilen ko‘ki bilan 5 dan 10 daqiqagacha bo‘yang.
4. Suvda chaying va 5 dan 15 daqiqagacha rangsizlantiring, natijani qayd eting, so‘ng gibridizatsiyadan oldin qolgan bo‘yoqni olib tashlang.

Northern ishlarida asosan musbat zaryadlangan neylon qo‘llanadi. Nitrosellyuloza ham xuddi shu sirka kislotasi va asetat ish jarayoniga mos keladi. Tasvir ko‘chirishni tasdiqlash, 28S va 18S tasmalarni (yoki bakterial RNK uchun 23S va 16Sni) taqqoslash, markerlar va standartlarni belgilash hamda umumiy RNKni taxminiy normallashtirish qaydini saqlash uchun ishlatiladi. Chop etilgan Northern usullarida yuklashni tekshirish uchun bo‘yalgan ribosomal tasmalar miqdoriy baholanadi. Bunga normallashtirish uchun metilen ko‘ki bilan bo‘yalgan ribosomal tasmalar qo‘llangan sut mahsulotlari ilmiga oid ish ham kiradi. Southern membranalarini ham shu yo‘l bilan ko‘rinadigan qilish mumkin, ammo bo‘yoq Northern usulida yuklash va ko‘chirishni tekshirish vositasi sifatida ancha keng o‘rnashgan. Southern DNKsi ko‘chirishdan oldin denaturatsiya qilinadi, shuning uchun gel uchun sezgirlik ko‘rsatkichlarini unga tatbiq qilib bo‘lmaydi.

Aniqlash chegaralari va fon: ko‘k bo‘yoq qayerda yutqazadi

Quyidagi taqqoslash ataylab taxminiy berilgan. Bo‘yoqning ishlashi gel foizi, tasma kengligi, optika va rangsizlantirish tartibiga qat’iy amal qilishga bog‘liq. Har bir sonni aniq texnik ko‘rsatkich emas, miqdor tartibi sifatida qabul qiling.

Fon nazorati uncha kuchli bo‘lmagan signalning yaroqliligini belgilaydi. Erkin bo‘yoq juda kuchli rangga ega, shuning uchun kontrast bog‘langan bo‘yoqni chiqarib yubormasdan, bog‘lanmagan bo‘yoqni olib tashlash orqali hosil bo‘ladi. Konsentratsiyani oshirish kamdan-kam hollarda sezgirlikni kuchaytiradi. U asosan rangsizlantirish vaqtini uzaytiradi. Aynan foydalaniladigan gel, membrana va kamerada ketma-ket suyultirish qatorini sinang va faqat integrallangan zichlik kiritilgan miqdorga mutanosib bo‘lib qoladigan diapazondan foydalaning. Metilen ko‘ki yuklashni yarim miqdoriy normallashtirishga imkon beradi. U keng dinamik diapazonli miqdoriy tahlil emas, chunki membrana sig‘imi, ko‘chirish samaradorligi, to‘yinish va rangsizlantirish yo‘lakdan yo‘lakka o‘zgaradi.

Moslik cheklovlari: bo‘yashdan keyin nimalar yaroqli qoladi

Ko‘k bo‘yoq bilan bo‘yashdan keyin klonlash mumkinligi ko‘rsatilgan. Flores va hamkasblari bo‘yalgan agaroza tasmalarini kesib olgan, DNKni ajratib olgan, ligatsiya va transformatsiya qilgan; ular etidiy bromid va UVdan keyingiga qaraganda yaxshiroq klonlash natijalarini qayd etgan. Ehtimoliy sabab bo‘yoqning o‘zidan keladigan foyda emas, balki kamroq fotoshikastlanishdir. Oq yorug‘lik ta’sirini qisqa tuting va ajratib olingan DNKni odatiy geldan ekstraksiya qilish tozalash bosqichidan o‘tkazing.

PCR va sekvenslash bo‘yicha dalillar kamroq. Qoldiq bo‘yoq nuklein kislotalarga bog‘lanadi, shuning uchun fermentativ bosqichlardan oldin rangsizlantiring va tozalang. Ko‘k bo‘yoq bilan bo‘yalgan geldan to‘g‘ri tozalangan DNK ishlashi kutiladi, ammo turli polimerazalar va sekvenslash kimyolarining bevosita o‘tib qolgan bo‘yoqqa chidamliligi yaxshi miqdoriy baholanmagan. Buni o‘z-o‘zidan to‘g‘ri deb hisoblamang.

Blot gibridizatsiyasi qat’iy ketma-ketlikka amal qilinganda mos keladi: ko‘chirish, immobilizatsiya, bo‘yash, qayd etish, rangsizlantirish, gibridizatsiya. Bu Herrin va Schmidt ishlab chiqqan tartibdir. Ko‘chirishdan oldin bo‘yash yoki rangsizlantirishni o‘tkazib yuborish — boshqa usul bo‘lib, alohida tasdiqlashni talab qiladi. Bo‘yoq olib tashlangach, zondni standart usulda olib tashlash va qayta zondlash odatdagidek davom etadi. Shu bo‘yoqlar oilasi bilan hujayra darajasida bo‘yash va nima uchun fiksatsiyalangan surtma yondashuvi tirik hujayra usullariga tatbiq etilmasligi haqida mikroskopiyada bo‘yash atlasiga qarang.

Doimiy fiksatsiya varianti qo‘llanmasa, tasmalarni kesib olish preparativ agaroza va ko‘k bo‘yoq bilan joyi aniqlangan PAGE oligonukleotidlari uchun mos keladi. Qaytar bog‘lanadigan modda uchun rangsizlantirishdan keyingi elektroelyutsiya kimyoviy jihatdan asosli, ammo aynan metilen ko‘kiga oid nazoratli chiqim ma’lumotlari kam. Elyutsiyadan keyin tuzsizlantiring yoki cho‘ktiring.

Takrorlanadigan muvaffaqiyatsizliklar

Gel tasmalarining xira bo‘lishi odatda kolorimetrik bo‘yoq uchun massa juda kamligini anglatadi, ayniqsa qisqa bir zanjirli yoki RNK nishonlarida. Ko‘proq namuna yuklang, yangi bo‘yoq ishlating, konsentratsiyani oshirishdan oldin bo‘yash vaqtini uzaytiring va rangsizlantirishni ertaroq to‘xtating. Kontrastsiz, butunlay ko‘k gel odatda ortiqcha bo‘yash yoki suvni yetarlicha almashtirmaslikni bildiradi. PAGE tasmalarining xiralashishi bo‘yash muvaffaqiyatsizligi emas, kutiladigan kimyoviy holatdir. Tez suratga oling. Membrana fonining notekisligi burmalar, pufakchalar, barmoq izlari, notekis chayqatish yoki joyma-joy ko‘chirishga ishora qiladi. Gibridizatsiya nazoratisiz buni noteng yuklash deb talqin qilmang. Yoyilgan, kuchsiz ribosomal ko‘rinish parchalanishni bildirishi mumkin, ammo to‘liq bo‘lmagan ko‘chirish, umumiy RNKning kamligi (odatdagi yo‘laklarga bir necha mikrogrammdan o‘nlab mikrogrammgacha yuklanadi) yoki ortiqcha rangsizlantirish ham sabab bo‘lishi mumkin. Bo‘yoq ko‘p miqdordagi ribosomal RNKni ko‘rsatadi. U muayyan transkriptni ko‘rsatmaydi. Bu vazifa zondga tegishli.

Ortiqcha da’volarsiz xavfsizlik va ishlatish

Metilen ko‘ki bilan ishlash etidiy bromidga qaraganda soddaroq, ammo u zararsiz emas. Amaldagi MilliporeSigma xavfsizlik ma’lumotlari varaqasi bo‘yoqni og‘iz orqali o‘tkir zaharlilikning 4-toifasiga kiritadi: yutilsa zararli. Sigma-Aldrich metilen ko‘ki SDS hujjatiga ko‘ra, u tasdiqlangan chiqindi yo‘li orqali utilizatsiya qilinishi kerak. Etidiy bromid uchun genotoksiklikka oid kuchliroq ogohlantirishlar mavjud; uning Sigma-Aldrich etidiy bromid SDS hujjatida jinsiy hujayralarga gumon qilinadigan ta’sirlar ham keltirilgan. Thermo Fisher nuklein kislota bo‘yoqlari qo‘llanmasida qayd etilganidek, uning gellari va eritmalari odatda xavfli kimyoviy chiqindi sifatida alohida yig‘iladi. Har ikkisi uchun SDS va muassasa qoidalariga amal qiling. Quruq bo‘yoqni mahkam yopilgan holda va quruq saqlang, ishchi bo‘yoq eritmasini faqat protokol ruxsat etgan darajada qayta ishlating, bo‘yalgan membranalarni filtr qog‘ozi varaqlari orasida quruq saqlang va tasmalar diffuziya tufayli yoyilib ketishidan oldin gellarni suratga oling.

Laboratoriyadagi asosiy jumlani esda tuting. Gellar oq yorug‘likda yuqori yuklamadagi ko‘rinuvchanlikni tekshiradi. Membranalar zond sezgir tekshiruvni bajarishidan oldin ko‘chirish va yuklashni tekshiradi. Bitta bo‘yoq ikkala vazifaga ham xizmat qiladi: sezgirligi uncha yuqori emas, bog‘lanishi qaytar va amallar ketma-ketligiga qat’iy rioya qilish kerak.