EMB agarda E. coli va boshqa koloniyalarning ko‘rinishini talqin qilish

Talaba noma’lum mikroorganizmni eozin-metilen ko‘k agariga shtrix usulida ekadi, tun davomida inkubatsiya qiladi va qaytib kelganda plastinkada yashil tovlanadigan to‘q rangli koloniyalarni ko‘radi. Daftarga «E. coli, tasdiqlandi» deb yozadi. Bu yozuv plastinka asosida chiqarish mumkin bo‘lgan xulosadan ortig‘ini da’vo qiladi. Plastinka muayyan sharoitlardagi o‘sish va fermentatsiya fenotipini ko‘rsatadi. Mikroorganizmning qaysi turga mansubligi esa alohida dalillarni talab qiladigan alohida xulosadir.

Ushbu qo‘llanma EMB agar natijalarini talqin qilish vazifasi sifatida ko‘rib chiqadi. U asosiy tamoyilni tushuntiradi, nazorat namunalari bilan birga tasviriy plastinkalar atlasini ko‘rib chiqadi va darslikdagi ko‘rinish chalg‘itadigan holatlarni ko‘rsatadi.

Plastinka ishlashining asosiy tamoyili

EMB agar ham selektiv, ham differensial muhitdir. Eozin Y va metilen ko‘k bo‘yoqlari ko‘plab Gram-musbat mikroorganizmlarning o‘sishini bostiradi, shu sababli muhit Gram-manfiy mikroorganizmlarning o‘sishiga qulaylik yaratadi. Xuddi shu bo‘yoqlar indikator vazifasini ham bajaradi: mikroorganizm mavjud shakarni fermentlab, mahalliy ravishda yetarli miqdorda kislota hosil qilganda, koloniya bo‘yoqni kuchli singdiradi va to‘q binafshadan ko‘kimtir qoragacha tus oladi. Kislota jadal hosil bo‘lganda koloniya yuzasida metallga xos yashil tovlanish paydo bo‘lishi mumkin. ASMning eozin-metilen ko‘k agar plastinkalari bo‘yicha protokoli selektivlik va differensiatsiyaning bu uyg‘unligini tavsiflaydi hamda o‘qitish uchun namunaviy fotosuratlarni taqdim etadi.

Har qanday natijani talqin qilishdan oldin bir jihat muhim: qaysi tarkibli muhit ishlatilayotganini tekshiring. Eski Holt Harris Teague tarkibida laktoza va saxaroza bor, Levine EMB tarkibida esa faqat laktoza mavjud. Saxarozani fermentlaydigan, lekin laktozani fermentlamaydigan mikroorganizm, masalan, Serratia marcescens ning ko‘plab izolyatlari, bu ikki variantda turlicha ko‘rinishi mumkin. EMB muhitlari bo‘yicha ishlab chiqaruvchi hujjatlari tarkibdagi ushbu farqni aniq ko‘rsatadi. Natija bilan birga ishlab chiqaruvchi va muhit tarkibini ham daftarga yozing.

Tayyorlangan, hali mikroorganizm ekilmagan EMB agar odatda qizg‘ish jigarrangdan qizg‘ish binafshagacha bo‘ladi, ba’zan yashilimtir tus yoki mayda cho‘kma kuzatiladi. Bu fon rangi o‘sish belgisi emas. Har bir kuzatuvni mikroorganizm ekilmagan plastinka yoki hujjatlashtirilgan boshlang‘ich ko‘rinish bilan solishtiring. O‘quv protokolida boshqacha ko‘rsatilmagan bo‘lsa, birlamchi plastinkani 35 dan 37 C gacha haroratda, aerob sharoitda taxminan 18 dan 24 soatgacha inkubatsiyadan so‘ng baholang. Uzoqroq inkubatsiya fermentatsiyaning tashqi ko‘rinishini o‘zgartirishi mumkin.

Plastinkani qanday kuzatish kerak

Yoritishning ikki turidan foydalaning. Avval plastinkani qaytgan yoki qiya tushayotgan yorug‘likda ko‘rib, uni og‘diring: metall yaltiroqlik tovlanadi va ko‘rish burchagiga qarab paydo bo‘lishi yoki yo‘qolishi mumkin. Keyin koloniya rangi va to‘q markazlarini baholash uchun plastinkani undan o‘tuvchi yorug‘likda ko‘ring. Yaxshi ajralgan koloniyalar bilan ishlang, chunki zich o‘sish va qo‘shni koloniyalar mahalliy kislota to‘planishini o‘zgartiradi hamda rangni susaytirishi yoki kuchaytirishi mumkin. ASM tasvirlar to‘plami buni bevosita ko‘rsatadi: aralash kulturadagi E. coli kutilgan yaltiroqligini yo‘qotishi mumkin, chunki atrofdagi mikroorganizmlar muhitning kislotaliligini o‘zgartiradi.

Mashg‘ulot imkon berganda nazorat namunalarini qo‘shing. O‘qitishda keng qo‘llanadigan to‘plamga ko‘kimtir qora rang va metall yaltiroqlik fenotipi uchun E. coli ATCC 25922, rangsiz fenotip uchun Salmonella Typhimurium ATCC 14028 yoki Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 kabi fermentlamaydigan mikroorganizm hamda o‘sishning bostirilishini nazorat qilish uchun Enterococcus faecalis yoki Staphylococcus aureus kabi Gram-musbat mikroorganizm kiradi. Bular EMB muhitlari uchun standart sifat nazorati jadvallarida keltirilgan. Musbat nazoratda yaltiroqlik bo‘lmasa, noma’lum namunadan shubhalanishdan oldin inkubatsiya, zich o‘sish yoki muhit tarkibini tekshiring.

Tasviriy plastinkalar atlasi

Quyidagi plastinkalar haqiqiy kulturalarning fotosuratlari emas, balki yaratilgan tasvirlardir. Ular alohida bir shtammning aniq tusini emas, izlash kerak bo‘lgan ko‘rinishni ko‘rsatadi. Ularni ASMning namunaviy fotosuratlari va o‘quv laboratoriyasidagi haqiqiy plastinkalar bilan solishtiring.

Plastinka 1: EMB agarda Escherichia coli, laktozani jadal fermentlovchi mikroorganizm

EMB agardagi E. coli odatda to‘q binafshadan ko‘kimtir qoragacha rangda bo‘lib, ko‘pincha to‘q markazga va kislota jadal hosil bo‘lishi tufayli metallga xos yashil yaltiroqlikka ega bo‘ladi. Yaltiroqlik talabalar izlaydigan mashhur belgidir, ammo uni aniqlovchi mezon emas, balki qo‘shimcha dalil sifatida ko‘ring. Yaltiroqlikning kuchi shtamm, inkubatsiya vaqti, koloniyalar zichligi va ko‘rish burchagiga qarab o‘zgaradi. Yaltiroqlikning yo‘qligi E. coli ni istisno qilmaydi, yaltiroqliksiz to‘q koloniya esa bir nechta boshqa fermentlovchi mikroorganizmlarga ham mos keladi. Keyingi har qanday tekshiruv uchun zich o‘sgan qismni baholash o‘rniga yaxshi ajralgan koloniyani tanlang.

Plastinka 2: EMB agarda Klebsiella pneumoniae, shilimshiq koloniyali fermentlovchi mikroorganizm

EMB agardagi Klebsiella pneumoniae odatda pushti-binafshadan jigarrang-binafshagacha tusdagi yirik, yaltiroq, shilimshiq koloniyalar hosil qiladi. Ularning markazlari ko‘pincha to‘q bo‘ladi, ammo odatda kuchli metall yaltiroqligi kuzatilmaydi. Enterobacter kabi yaqin fermentlovchi mikroorganizmlarda ham o‘xshash morfologiya uchraydi. Shilimshiq tuzilish va koloniya kattaligi talqinning bir qismidir: kichik va yassi pushti koloniyaning talqindagi ahamiyati yirik, gumbazsimon, shilimshiq koloniyanikidan farq qiladi. E. coli holatida bo‘lgani kabi, plastinka fermentatsiya fenotipini taxmin qilishga imkon beradi, tur darajasida nomlash esa quyida tavsiflangan biokimyoviy tasdiqlashni talab qiladi.

Plastinka 3: EMB agarda Salmonella va boshqa fermentlamaydigan mikroorganizmlar, rangsiz koloniyalar

EMB agardagi Salmonella va unga o‘xshash laktozani fermentlamaydigan mikroorganizmlar, jumladan Shigella va ko‘plab Pseudomonas izolyatlari, odatda rangsizdan yarim shaffofgacha yoki och qahrabo tusli koloniyalar hosil qiladi. Ayrim tarkiblar va sharoitlarda nim pushti tus paydo bo‘ladi, shuning uchun och pushti koloniya avtomatik ravishda fermentlovchi mikroorganizmni anglatmaydi. EMB Salmonella ni Shigella dan yoki boshqa fermentlamaydigan mikroorganizmlardan ajratmaydi; bu farq keyingi sinovlarda aniqlanadi. Shuningdek, E. coli nikiga o‘xshash metall yaltiroq koloniyalar hosil qiladigan, laktoza bo‘yicha musbat Salmonella shtammlari hujjatlashtirilganini ham unutmang. Bu bitta plastinka yakuniy xulosa uchun yetarli emasligining yana bir sababidir.

Plastinka 4: Serratia marcescens va muhit tarkibi bilan bog‘liq chalg‘ish

Serratia marcescens alohida bo‘limga loyiq, chunki talabalar ko‘pincha qizil koloniyalarni kutib, keyin plastinkani noto‘g‘ri talqin qiladilar. Ko‘pchilik klinik izolyatlar laktozani fermentlamaydi, shu sababli Levine EMB da ular odatda och tusli yoki sust ranglangan ko‘rinadi. Ko‘plab izolyatlar saxarozani fermentlagani uchun tarkibida saxaroza bo‘lgan muhitda to‘qroq yoki kislota hosil bo‘lishi bilan kuchliroq bog‘liq reaksiya kuzatilishi mumkin. 35 dan 37 C gacha haroratda odatiy qizil prodigiozin pigmentini ham kutmang; inkubator haroratida pigment hosil bo‘lishi barqaror emas. Protokolda EMB agardagi Serratia marcescens tilga olinganda, bu tavsif qaysi muhit tarkibiga asoslanganini tekshiring. Serratia metabolizmi haqidagi sharh bu chalg‘ishning asosidagi laktoza bo‘yicha manfiy va saxaroza bo‘yicha o‘zgaruvchan xususiyatlarni umumlashtiradi.

Plastinka 5: nazorat namunalari va o‘sishi bostirilgan mikroorganizmlar

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus va Bacillus kabi Gram-musbat mikroorganizmlarning o‘sishi EMB agarda odatda to‘xtatiladi yoki sezilarli darajada bostiriladi, biroq bu ta’sir barcha shtammlar uchun mutlaq emas. Nazorat namunalari to‘plami ishonchli talqin qilishga yordam beradi: E. coli nazorati ko‘kimtir qora rang va yaltiroqlik bilan yaxshi o‘sishi, fermentlamaydigan mikroorganizm nazorati rangsiz o‘sishi, o‘sishni bostirish nazoratida esa o‘sish kam yoki umuman bo‘lmasligi kerak. Agar o‘sishni bostirish nazorati yaxshi o‘ssa, selektivlik bosqichi ishlamagan va shu partiyadagi boshqa barcha natijalar shubhali hisoblanadi. Bo‘yash usullari oziqa muhitlaridan boshqa savolga javob beradi; laboratoriyada buyum oynasidagi preparatlarni bo‘yash haqida metilen ko‘k bilan bo‘yash atlasiga qarang.

Talqin chegaralari bilan taqqoslash

Chalg‘ituvchi ko‘rinishlarni uchta jumla umumlashtiradi. To‘q rang E. coli degani emas, chunki Klebsiella, Enterobacter va boshqa fermentlovchi mikroorganizmlar yaltiroqliksiz to‘q markazlar hosil qiladi. Pushti rang Klebsiella degani emas, chunki o‘rtacha yoki sekin fermentlovchi mikroorganizmlar hamda odatda fermentlamaydigan deb tasniflangan ayrim mikroorganizmlar pushti yoki och binafsha ko‘rinadi. Yaltiroqlik E. coli ning aniq tasdig‘i emas, chunki uni boshqa jadal fermentlovchi mikroorganizmlar ham hosil qilishi mumkin. O‘quv protokoli va undagi aralash kultura tasvirlari bu noto‘g‘ri xulosalarning har birini ko‘rsatadi.

Tasdiqlash chegaralari

EMB agar turni emas, fenotipni ko‘rsatadi. Turli mikroorganizmlar bir xil koloniya ko‘rinishiga ega bo‘lishi mumkin, bitta mikroorganizm esa shtamm, kultura yoshi, zich o‘sish, muhit tarkibi va inkubatsiyaga qarab darslikdagi ko‘rinishidan farq qilishi mumkin. Shu sababli o‘quv va klinik ish jarayonlarida EMB morfologiyasi taxminiy belgi sifatida qaraladi.

Talaba uchun asosli ish tartibi quyidagicha: ajralgan koloniyani tavsiflash (kattaligi, rangi, markazi, qiya yorug‘likdagi yaltiroqligi, shilimshiq xususiyati), muhit tarkibi, inkubatsiya vaqti va harorati hamda nazorat namunalarini qayd etish; so‘ng har qanday tasdiqlovchi sinovdan oldin yaxshi ajralgan koloniyani qayta ekib, sof kultura olish. Odatdagi keyingi tekshiruvlar taxminiy E. coli va koliformlarni identifikatsiya qilish uchun Gram usulida bo‘yash hamda IMViC reaksiyalarini, ichak mikroorganizmlari uchun TSI yoki KIA va mikroorganizmga xos biokimyoviy sinovlar to‘plamini o‘z ichiga oladi. Vazifa talab qilganda serologik, MALDI TOF yoki boshqa validatsiyalangan identifikatsiya usullari qo‘llanadi. EMB ning ichak mikroorganizmlari uchun selektiv va differensial muhitlar orasidagi o‘rni haqida ma’lumot uchun ichak mikroorganizmlarini o‘stirish muhitlariga oid kirish materiallari va Gram usulida bo‘yash bilan keyingi tekshiruvga qarang. Buyum oynasidagi ko‘k bo‘yoq bilan bo‘yalgan preparat nimani isbotlay olishi va nimani isbotlay olmasligi haqidagi bog‘liq savolda metilen ko‘k bilan bo‘yash atlasi ham xuddi shu yondashuv bilan kuzatuvni xulosadan ajratadi.

Xulosadan oldin kuzatuvni yozing. «Levine EMB da 24 soatdan so‘ng ko‘rish burchagiga bog‘liq yashil yaltiroqlikka ega to‘q ko‘kimtir qora koloniyalar kuzatildi, bu laktozaning jadal fermentatsiyasiga mos keladi» — asosli qayd. «E. coli, tasdiqlandi» deyish esa plastinkaning o‘zi ta’minlay olmaydigan tasdiqlash bosqichini talab qiladi.