G6PD کے لیبارٹری ٹیسٹوں میں میتھیلین بلیو: یہ رنگ دراصل کیا کرتا ہے

ایک طالب علم انکیوبیشن کے بعد دو ٹیوبوں کا مشاہدہ کرتا ہے۔ ایک کا رنگ توقع کے مطابق بدل گیا ہے۔ دوسری کا نہیں بدلا۔ طالب علم یہ نتیجہ اخذ کرتا ہے کہ دوسرے مریض میں گلوکوز-6-فاسفیٹ ڈی ہائیڈروجنیز کی کمی ہے۔ یہ نتیجہ درست ہو سکتا ہے، لیکن اس استدلال میں وہ تصور نظر انداز ہو جاتا ہے جس کی بنیاد پر ٹیسٹ کام کرتا ہے۔ ٹیوب میں کوئی چیز براہِ راست انزائم کی پیمائش نہیں کرتی۔ ٹیوب میتھیلین بلیو کو واسطے کے طور پر استعمال کرتے ہوئے اس چیز کی پیمائش کرتی ہے جو انزائم پیدا کرتا ہے۔

جب پیمائش کا یہ بالواسطہ طریقہ واضح ہو جائے، تو طریقۂ کار، کنٹرول نمونے اور غلط نتائج کی طویل فہرست، سب کی وجہ سمجھ میں آنے لگتی ہے۔

مختصر جواب

G6PD کی جانچ میں میتھیلین بلیو ایک ریڈوکس اشاریہ ہے۔ G6PD انزائم NADPH پیدا کرتا ہے، اور NADPH پر منحصر نظام نیلے میتھیلین بلیو کی تخفیف کر کے اسے اس کی بے رنگ لیوکو شکل میں تبدیل کرتے ہیں، یا اسے الیکٹرانوں کی منتقلی کے لیے استعمال کرتے ہیں۔ انزائم کی معمول کی سرگرمی سے تخفیف مؤثر انداز میں ہوتی ہے۔ کم سرگرمی سے تخفیف سست یا نامکمل ہوتی ہے۔ ٹیسٹ کا پورا اشارہ یہی ہے۔

دو تاریخی طریقوں میں یہی رنگ استعمال ہوتا ہے، لیکن ان کے اختتامی مشاہدات مختلف ہیں۔ انہیں الگ سمجھیں تو زیادہ تر الجھن دور ہو جاتی ہے۔

دو ٹیسٹ، ایک رنگ، مختلف اختتامی مشاہدات

پہلا، میتھیلین بلیو کی براہِ راست تخفیف کا ٹیسٹ ہے، جسے ساس اور ان کے ساتھیوں نے بیان کیا اور بعد میں گبز نے جانچا۔ اس میں اختتامی مشاہدہ خود رنگ ہے: آکسیڈائز شدہ نیلے میتھیلین بلیو کی تخفیف سے وہ بے رنگ لیوکومیتھیلین بلیو کی طرف تبدیل ہوتا ہے، اور اس تبدیلی کی شرح NADPH پیدا کرنے کی صلاحیت ظاہر کرتی ہے۔ اسکریننگ کا بنیادی مقالہ PubMed پر Sass et al. (1966) کے تحت درج ہے۔

دوسرا، بریور میٹ ہیموگلوبن تخفیف ٹیسٹ ہے۔ سوڈیم نائٹرائٹ پہلے ہیموگلوبن کو آکسیڈائز کر کے بھورے میٹ ہیموگلوبن میں تبدیل کرتا ہے۔ اس کے بعد میتھیلین بلیو الیکٹرانوں کی منتقلی میں واسطے کا کردار ادا کرتا ہے: تخفیف شدہ میتھیلین بلیو میٹ ہیموگلوبن کو تخفیفی قوت منتقل کرتا ہے، جس سے وہ دوبارہ سرخ ہیموگلوبن میں تبدیل ہو جاتا ہے۔ لہٰذا نظر آنے والا اختتامی فرق بھورے اور سرخ رنگ کے درمیان ہوتا ہے، نیلے اور بے رنگ کے درمیان نہیں۔ اصل طریقہ عالمی ادارۂ صحت کے بلیٹن (Brewer et al., 1960) میں شائع ہوا تھا۔

بریور جانچ کو رنگ کی بے رنگی کا ٹیسٹ کہنا کیمیائی اعتبار سے غیر دقیق ہے۔ رنگ آکسیڈیشن اور تخفیف کے چکر سے گزرتا ہے؛ ہیموگلوبن کا رنگ بدلتا ہے۔ نیچے دیا گیا خاکہ دونوں راستے دکھاتا ہے۔

بنیادی تعامل

G6PD پینٹوز فاسفیٹ راستے کے پہلے آکسیڈیٹو مرحلے کو انگیز کرتا ہے:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

بالغ سرخ خلیے NADPH کے لیے اس راستے پر بہت زیادہ انحصار کرتے ہیں، جیسا کہ Blood میں لوزاٹو اور ان کے ساتھیوں کے جائزے (2020) میں بیان کیا گیا ہے۔ NADPH گلوٹاتھائیون کو تخفیف شدہ حالت میں رکھتا ہے اور خلیے کو آکسیڈیٹو نقصان سے بچاتا ہے۔ میتھیلین بلیو الیکٹران قبول کرنے والے مادے کے طور پر اس نظام کا حصہ بنتا ہے۔ کافی G6PD سے کافی NADPH بنتا ہے، جس سے تخفیف مؤثر ہوتی ہے۔ کم G6PD اس سلسلے کو پہلی ہی کڑی پر توڑ دیتا ہے۔

رنگ کو انجن کے بجائے ایندھن کی مقدار بتانے والا میٹر سمجھیں۔ یہ NADPH کی دستیابی کا پتا دیتا ہے۔ کوئی بھی دوسری چیز جو اس دستیابی یا نتیجے کی قرأت کو بدل دے، جین میں کسی تبدیلی کے بغیر بھی میٹر کے اشارے کو بدل سکتی ہے۔

بریور طرز کا طریقۂ کار کیسے انجام دیا جاتا ہے

کئی دہائیوں کے دوران ری ایجنٹس کی ترکیبیں مختلف رہی ہیں، اس لیے تدریسی وضاحت کو طبی جانچ کا پروٹوکول نہیں سمجھنا چاہیے۔ ہر لیبارٹری اپنے توثیق شدہ معیاری طریقۂ کار کی پیروی کرتی ہے۔ اس احتیاط کے ساتھ، ٹیوبوں کا روایتی انتظام یوں کام کرتا ہے۔ اس شائع شدہ عملی طریقے میں اسے تین ٹیوبوں اور 3 گھنٹے کی انکیوبیشن کے ساتھ بیان کیا گیا ہے:

1. مریض کی ٹیوب: مکمل خون کے ساتھ گلوکوز، سوڈیم نائٹرائٹ اور میتھیلین بلیو۔ نائٹرائٹ میٹ ہیموگلوبن بناتا ہے، گلوکوز سرخ خلیوں کے میٹابولزم کو غذا فراہم کرتا ہے، اور رنگ NADPH پر منحصر منتقلی کا واسطہ فراہم کرتا ہے۔
2. آکسیڈائز شدہ کنٹرول: خون کے ساتھ نائٹرائٹ اور گلوکوز، لیکن میتھیلین بلیو کے بغیر۔ یہ بھورے میٹ ہیموگلوبن کا اختتامی رنگ دکھاتا ہے، جو کمی کی صورت میں نظر آنے والا نمونہ ہے۔
3. ہیموگلوبن کنٹرول: خون کے ساتھ پانی۔ یہ سرخ ہیموگلوبن کا اختتامی رنگ دکھاتا ہے، جو معمول کی صورت میں نظر آنے والا نمونہ ہے۔
4. تمام ٹیوبوں کو تقریباً 37 C پر، عموماً 3 گھنٹے تک، ہلکے سے ملاتے ہوئے انکیوبیٹ کریں۔
5. ہر ٹیوب کی تھوڑی سی مقدار کو مقطر پانی میں رقیق کریں تاکہ خلیے ٹوٹ جائیں اور رنگوں کا موازنہ واضح ہو سکے۔
6. مریض کی ٹیوب کا دونوں کنٹرول نمونوں سے موازنہ کریں۔ رنگ کا دوبارہ سرخی کی طرف آنا خاطرخواہ تخفیفی صلاحیت ظاہر کرتا ہے۔ بھورا رنگ برقرار رہنا نمایاں کمی کی طرف اشارہ کرتا ہے۔

ایک تاریخی ترکیب میں تقریباً 1 mL خون کے ساتھ ری ایجنٹس میں لگ بھگ 180 mM سوڈیم نائٹرائٹ، 280 mM ڈیکسٹروز اور 0.4 mM میتھیلین بلیو استعمال کیے گئے تھے۔ ان اعداد کو شائع شدہ مواد کی ایک مثال سمجھیں، کوئی آفاقی معیار نہیں۔

نتیجہ سمجھنا

کیفی اسکریننگ معمول کی سرگرمی کے تقریباً 30 سے 40 فیصد کی سطح پر سب سے بہتر امتیاز کرتی ہے، جیسا کہ G6PD کی شناخت میں خلا کے بارے میں Malaria Journal کے اس جائزے میں بیان کیا گیا ہے۔ اس لیے اسکریننگ کا معمول کا نتیجہ یہ بتاتا ہے کہ جانچ میں شدید کمی کی شناخت نہیں ہوئی۔ یہ مکمل طور پر معمول کی سرگرمی کی تصدیق نہیں کرتا۔

اسکریننگ گمراہ کیوں کرتی ہے

ہیمولائسز کے بعد ریٹیکیولوسائٹوسس غلط طور پر معمول کا نتیجہ آنے کی معروف وجہ ہے۔ نوجوان سرخ خلیوں اور ریٹیکیولوسائٹس میں پرانے خلیوں کی نسبت زیادہ G6PD ہوتا ہے۔ ہیمولائسز کے ایک شدید واقعے کے دوران سب سے پرانے اور سب سے زیادہ کمی والے خلیے پہلے ہی تباہ ہو چکے ہو سکتے ہیں۔ اس کے بعد نوجوان خلیوں کی ایسی آبادی باقی رہتی ہے جس کی سرگرمی جانچ میں معمول کے مطابق آتی ہے۔ یہی حیاتیاتی عمل مقداری جانچوں کو بھی گمراہ کرتا ہے، صرف رنگ پر مبنی اسکریننگ کو نہیں۔

حالیہ انتقالِ خون کمی کو چھپا دیتا ہے، کیونکہ عطیہ دہندہ کے سرخ خلیے نمونے میں اپنا انزائم شامل کرتے ہیں۔ Mayo Clinic Laboratories انتقالِ خون کو ریٹیکیولوسائٹوسس اور سفید خلیوں کی مداخلت کے ساتھ انزائم کے غیر معتبر نتائج کی وجوہات میں شمار کرتی ہے۔

ہیٹروزیگس خواتین سب سے مشکل صورت ہیں۔ X کروموسوم کے بے ترتیب غیرفعال ہونے سے معمول اور کمی والے سرخ خلیوں کا مرکب بنتا ہے، اور مجموعی سرگرمی شدید کمی سے لے کر بظاہر معمول تک کسی بھی سطح پر ہو سکتی ہے۔ کیفی اسکریننگ میں درمیانی فینوٹائپس کی شناخت اکثر نہیں ہوتی۔ G6PD کی جانچ سے متعلق WHO کی دستاویز میں اس حد پر تفصیلی بحث کی گئی ہے۔

نمونے کی عمر، ذخیرہ کرنے کا درجۂ حرارت، بصری اختتامی مشاہدے میں ذاتی رائے کا اثر، ہیمیٹوکرٹ اور ری ایجنٹس کا معیار ان حیاتیاتی اثرات کے علاوہ تجزیاتی نتائج میں مزید تغیر پیدا کرتے ہیں۔

اسکریننگ تشخیص نہیں ہے

اسکریننگ میں کمی، درمیانی سرگرمی یا طبی صورتِ حال سے مطابقت نہ رکھنے والا نتیجہ آنے پر G6PD انزائم کی مقداری جانچ ضروری ہوتی ہے۔ WHO درجۂ حرارت کو قابو میں رکھ کر کی جانے والی مقداری اسپیکٹروفوٹومیٹری کو حوالہ جاتی طریقہ سمجھتا ہے۔ اس جانچ میں سرخ خلیوں کے ہیمولائسیٹ میں گلوکوز-6-فاسفیٹ اور NADP+ شامل کیے جاتے ہیں، اور بننے والے NADPH کو 340 nm پر جذب میں اضافے کے ذریعے ناپا جاتا ہے۔ تبدیلی کی شرح انزائم کی سرگرمی کے متناسب ہوتی ہے، جسے عموماً ہیموگلوبن کی مقدار کے لحاظ سے فی گرام یونٹس میں ظاہر کیا جاتا ہے۔ موجودہ طبی لیبارٹری طریقوں کا خلاصہ G6PD سرگرمی کے لیے Mayo ٹیسٹ کیٹلاگ کے اندراج میں دیا گیا ہے۔

نتائج کی تشریح میں لیبارٹری کی توثیق شدہ حوالہ جاتی حد استعمال ہوتی ہے، جسے اکثر آبادی میں معمول کی سرگرمی کے تناسب سے بیان کیا جاتا ہے۔ کمی پر عموماً 30 فیصد کی حد کے قریب، اور درمیانی سرگرمی پر اس سے اوپر کی سطحوں کے حوالے سے بحث کی جاتی ہے۔ G6PD ٹیسٹوں کے لیے WHO کے ہدفی مصنوعات کے خاکے (2022) اس تشخیصی فریم ورک کی وضاحت کرتے ہیں۔ اگر حالیہ ہیمولائسز یا انتقالِ خون سے فینوٹائپ کی تعیین غیر معتبر ہو جائے، تو سرخ خلیوں کی آبادی دوبارہ توازن میں آنے کے بعد جانچ دہرائیں۔ سالماتی جانچ اضافی معلومات فراہم کر سکتی ہے، لیکن انزائم کی پیمائش کی جگہ نہیں لیتی۔

ایک ضروری امتیاز

ان جانچوں میں میتھیلین بلیو جسم سے باہر استعمال ہونے والا لیبارٹری ری ایجنٹ ہے۔ یہ بات مریض کو میتھیلین بلیو دینے کی حفاظت سے متعلق بحث سے الگ ہے، جس کا احاطہ میتھیلین بلیو کی ممانعتِ استعمال سے متعلق رہنمائی میں کیا گیا ہے۔ حیاتی کیمیا دونوں کو جوڑتی ہے، کیونکہ دوا بھی NADPH پر منحصر تخفیف پر انحصار کرتی ہے، لیکن ٹیسٹ ٹیوب میں موجود رنگ خون میں دی گئی خوراک نہیں ہوتا۔ کسی مختلف صورت میں رنگنے والے مادے کے طور پر اس رنگ کے رویے کو سمجھنے کے لیے میتھیلین بلیو سے رنگنے کے اصول دیکھیں، اور اس کے کیمیائی خاندان کے بارے میں جاننے کے لیے لیبارٹری میں ریڈوکس رنگوں کا موضوع دیکھیں۔

اسکریننگ یہ جانچتی ہے کہ تخفیفی صلاحیت برقرار نظر آتی ہے یا نہیں۔ تصدیقی جانچ یہ پوچھتی ہے کہ انزائم حقیقت میں کتنا موجود ہے۔ رنگ پہلے سوال کا اچھا جواب دیتا ہے، بشرطیکہ اس سے دوسرے سوال کا جواب نہ مانگا جائے۔