DNA اور RNA کی رنگ آمیزی کے لیے میتھیلین بلیو: جیل اور جھلیوں میں استعمال

ایک طالب علم ایگاروز جیل چلاتا ہے، اسے میتھیلین بلیو سے رنگتا ہے، اور جہاں ایک نمایاں بینڈ کی توقع تھی وہاں کچھ دکھائی نہیں دیتا۔ ساتھ والی لیبارٹری جگہ میں ایک پوسٹ ڈاک محقق اسی نیلی بوتل سے ناردرن جھلی کو رنگتا ہے اور تین منٹ میں واضح رائبوسومل بینڈ حاصل کر لیتا ہے۔ طالب علم نتیجہ نکالتا ہے کہ جیل ناکام ہو گئی۔ جیل ناکام نہیں ہوئی تھی۔ دونوں کام مختلف تھے، اور ایک ہی رنگ ان کے لیے مختلف حساسیت، مختلف پس منظر اور اگلے مراحل کے مختلف اصولوں کے ساتھ جواب دیتا ہے۔

میتھیلین بلیو سے DNA اور RNA کی رنگ آمیزی کی کیمیائی بنیاد ایک ہے، مگر مقصد مختلف ہے۔ جیل میں رنگ بتاتا ہے کہ مسام دار میٹرکس کے اندر کتنا نیوکلیک ایسڈ موجود ہے۔ جھلی پر یہ بتاتا ہے کہ منتقلی کامیاب ہوئی یا نہیں اور لینوں میں نمونہ یکساں مقدار میں ڈالا گیا یا نہیں۔ یہ فرق واضح ہو جائے تو طریقۂ کار، شناخت کی حدود اور مطابقت کی حدود سمجھ میں آ جاتی ہیں۔

مختصر جواب

میتھیلین بلیو ایک مسطح، مثبت بار رکھنے والا رنگ ہے جو نیوکلیک ایسڈز سے غیر اشتراکی اور قابلِ واپسی انداز میں جڑتا ہے۔ اس میں فاسفیٹ کی طرف برق سکونی کشش، بیس پیئرز کے درمیان داخل ہونا، اور چھوٹی نالی سے وابستگی شامل ہیں۔ یہی قابلِ واپسی ہونا اہم ہے۔ بینڈوں کو رنگ کر مرئی روشنی میں دیکھا اور ریکارڈ کیا جا سکتا ہے، پھر کلوننگ، ہائبرڈائزیشن یا دوبارہ پروب لگانے کے لیے رنگ ہٹایا یا نمونہ صاف کیا جا سکتا ہے۔

دو دھاگوں والے DNA کی ایگاروز جیل میں میتھیلین بلیو سے رنگ آمیزی کے لیے معیاری تیز ترکیب پانی میں 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) ہے؛ تقریباً 15 منٹ رنگ آمیزی اور تقریباً 15 منٹ پانی سے رنگ ہٹانے کے بعد اسے سفید روشنی والے لائٹ باکس پر دیکھا جاتا ہے۔ جھلیوں کے لیے روایتی ناردرن بلاٹ ترکیب pH 5.2 کے قریب سوڈیم ایسیٹیٹ میں 0.02 سے 0.04 percent رنگ ہے؛ منتقلی اور تثبیت کے بعد چند منٹ رنگ آمیزی، پھر پانی سے دھلائی اور ہائبرڈائزیشن سے پہلے مکمل طور پر رنگ ہٹانا۔ حساسیت محدود ہے: اچھی حالت میں ہر جیل بینڈ کے لیے دسیوں سے سینکڑوں نینوگرام، جبکہ محتاط رہنما 0.5 سے 1 microgram درج کرتے ہیں۔ یہ ایتھیڈیم برومائیڈ اور SYBR رنگوں کی حدود سے کئی درجے زیادہ ہے۔ جھلیوں پر کسی ایک ٹرانسکرپٹ کی شناخت کی کوئی مفید واحد حد نہیں، کیونکہ رنگ بنیادی طور پر وافر رائبوسومل RNA اور ڈالے گئے کل مادّے کو دکھاتا ہے۔ کسی بھی ترکیب میں تجارتی سپلیمنٹ محلول کو متبادل کے طور پر استعمال نہ کریں۔ توثیق شدہ طریقے تجزیاتی معیار کے رنگ، متعین بفرز اور RNA کی صورت میں RNase سے پاک ہینڈلنگ پر مبنی ہوتے ہیں۔

بندھن کیسے بنتا ہے، اور کہاں گمراہ کرتا ہے

مفید تصور کے تین حصے ہیں۔ پہلے، مثبت بار رکھنے والا حلقوی نظام منفی بار والے فاسفیٹ ڈھانچے کی طرف کھنچتا ہے۔ طیف بینی کی تحقیق میں کم نمک کی حالت میں یہ برق سکونی جزو غالب پایا گیا ہے، جبکہ ماڈلنگ اور سالماتی حرکیات دو دھاگوں والے DNA میں بیس پیئرز کے درمیان داخل ہونے اور چھوٹی نالی سے بندھن کو مستحکم طریقوں کے طور پر برقرار رکھتے ہیں، جیسا کہ میتھیلین بلیو اور DNA کے بندھن پر ایک طیف بینی مطالعے میں خلاصہ کیا گیا ہے۔ دوسرے، GC کے لیے کچھ ترجیح موجود ہے: ماڈلنگ CpG اور GpC مراحل کو ترجیح دیتی ہے، اور میتھیلین بلیو کے بیس پیئرز کے درمیان داخل ہونے کی ترجیحات پر تحقیق میں تجربات GC سے بھرپور دو دھاگوں والی ساختوں سے ترجیحی وابستگی دکھاتے ہیں، مگر AT والی دو دھاگوں کی ساختیں بھی بندھن بناتی ہیں۔ معمول کی رنگ آمیزی کسی مخصوص ترتیب تک محدود نہیں۔ تیسرے، ایک دھاگے والا DNA اور RNA بنیادی طور پر برق سکونی تعاملات اور دستیاب بیسز اور دو دھاگوں والے حصوں کے ساتھ تہہ در تہہ جڑنے کے ذریعے بندھن بناتے ہیں؛ اسی لیے رنگ کی شدت لمبائی، ترتیب اور ثانوی ساخت کے ساتھ بدلتی ہے۔

اس کے دو نتائج نکلتے ہیں۔ چونکہ بندھن غیر اشتراکی ہے، رنگ دھل کر نکل جاتا ہے۔ پولی ایکریلامائڈ کے بینڈ تیزی سے مدھم ہو جاتے ہیں، جب تک انہیں جان بوجھ کر مستقل طور پر تثبیت نہ کیا جائے۔ مستقل تثبیت کا ایک مخصوص متبادل طریقہ اسی لیے موجود ہے کہ عام رنگ آمیزی عارضی ہوتی ہے، جیسا کہ PAGE جیلوں کے لیے Soto اور Draper نے بیان کیا ہے۔ چونکہ یہ رنگ ضیائی حساس کنندہ ہے، آکسیجن کی موجودگی میں رنگے ہوئے DNA کو دیر تک تیز روشنی دینا گوانین کو آکسیڈائز کر سکتا ہے اور بالآخر دھاگوں میں کٹ لگا سکتا ہے۔ یہ عمل میتھیلین بلیو سے حساس کردہ گوانین کی آکسیڈیشن پر تحقیق میں تفصیل سے بیان ہوا ہے۔ سفید روشنی میں مختصر مشاہدہ روایتی ایتھیڈیم برومائیڈ طریقوں کے معروف UV نقصان سے بچاتا ہے، اور تیاری کے مقصد سے نمونہ واپس حاصل کرنے میں یہ واقعی ایک فائدہ ہے۔ مرئی روشنی نسبتاً نرم ہے، بے ضرر نہیں۔ اگر DNA کی کلوننگ ہونی ہے تو روشنی کی نمائش مختصر رکھیں۔ اس احتیاط کے پیچھے وسیع تر ضیائی کیمیا کے لیے میتھیلین بلیو کی ضیائی کیمیا کے دو راستے دیکھیے۔ ریڈوکس جوڑے اور بار کی ان حالتوں کے لیے جو واضح کرتی ہیں کہ آکسیڈائزڈ شکل کیوں جڑتی ہے اور تخفیف شدہ شکل کیوں نہیں، میتھیلین بلیو کی ساخت اور خواص کی کیمیا دیکھیے۔

پہلا کام: جیلوں کے اندر رنگ آمیزی

جیل کی رنگ آمیزی ایک سوال کا جواب دیتی ہے: کیا اس بینڈ میں اتنا نیوکلیک ایسڈ ہے کہ اسے آنکھ سے دیکھا جا سکے؟ ایگاروز میں دو دھاگوں والا DNA سب سے زیادہ اچھی طرح سمجھا گیا معاملہ ہے۔ Flores اور ساتھیوں کے میتھیلین بلیو جیل کے اصل طریقے نے 1 percent ایگاروز پر 0.02 percent کے تیز طریقے کی توثیق کی اور اس کے بعد کامیاب بازیافت اور کلوننگ دکھائی۔ فراہم کنندہ کا یہی طریقہ IBI Scientific کے میتھیلین بلیو مصنوعات کے صفحے پر بھی موجود ہے، جہاں 0.04 percent والی جھلی کی ترکیب اور تیز جیل طریقہ ساتھ ساتھ درج ہیں۔

عملی طریقۂ کار:

1. جیل معمول کے مطابق چلائیں۔ رنگ آمیزی الیکٹروفوریسس کے بعد کریں، اس دوران نہیں، الا یہ کہ ترمیم شدہ طریقے کے لیے منتقلی یا تفریق کی صلاحیت کی توثیق ہو چکی ہو۔
2. مقطر پانی میں 0.02 percent w/v میتھیلین بلیو کے اندر تقریباً 15 منٹ ڈبوئیں اور آہستہ ہلاتے رہیں۔
3. تقریباً 15 منٹ کے مجموعی دورانیے میں کئی بار پانی بدل کر رنگ ہٹائیں، یہاں تک کہ میٹرکس کے پس منظر کا رنگ کم ہو اور بینڈ نمایاں ہو جائیں۔
4. سفید روشنی والے روشن کنندہ پر فوراً تصویر لیں۔

ایگاروز اور پولی ایکریلامائڈ مختلف رویہ دکھاتے ہیں۔ ایگاروز میٹرکس میں رنگ روک کر رکھتا ہے، اس لیے رنگ ہٹانا سست مرحلہ ہے۔ باریک پولی ایکریلامائڈ جیلیں جلد رنگتی ہیں مگر رنگ بھی جلد کھو دیتی ہیں؛ یہ تیاری کے لیے بینڈ کاٹ کر نکالنے میں مدد دیتا ہے مگر محفوظ ریکارڈ رکھنے میں رکاوٹ بنتا ہے۔ پولی ایکریلامائڈ میں مصنوعی اولیگونیوکلیوٹائڈز کو اسی 0.02 percent ترکیب اور بار بار پانی سے دھلائی کے ساتھ 20 سے 30 منٹ میں تلاش کیا جا سکتا ہے، قائم شدہ Current Protocols طرز کے PAGE طریقوں کے مطابق۔ تیاری کے لیے اولیگوز کے معاملے میں پتلے TBE میں تقریباً 0.0002 percent کے بہت پتلے محلولوں کا کئی گھنٹوں تک استعمال بھی رپورٹ ہوا ہے، مگر اس کے شواہد کمزور ہیں۔

DNA اور RNA کا فرق اہم ہے۔ دو دھاگوں والا DNA سب سے مضبوط، ساخت سے وابستہ بندھن دیتا ہے۔ RNA اور ایک دھاگے والا DNA بھی رنگتے ہیں، مگر زیادہ کمزور اور کم قابلِ پیش گوئی انداز میں۔ فارملڈیہائڈ ایگاروز RNA جیلوں کے لیے بیشتر لیبارٹریاں جیل کے اندر نیلی رنگ آمیزی چھوڑ کر پہلے RNA کو جھلی پر منتقل کرتی ہیں، پھر وہاں رنگتی ہیں۔ اس تبدیلی سے جیل کے کمزور سگنل کی جگہ جھلی کا زیادہ واضح سگنل اور لوڈنگ کا ریکارڈ مل جاتا ہے۔

دوسرا کام: جھلیوں پر رنگ آمیزی

جھلی کی رنگ آمیزی ایک مختلف سوال کا جواب دیتی ہے: کیا منتقلی کامیاب ہوئی، اور کیا لینیں قابلِ موازنہ ہیں؟ اس کا روایتی استعمال Herrin اور Schmidt کی قابلِ واپسی ناردرن بلاٹ رنگ آمیزی ہے۔ اصل ترکیب pH 5.0 پر 50 mM سوڈیم ایسیٹیٹ میں 0.04 percent رنگ تھی، جس میں 2 سے 3 منٹ رنگ آمیزی کے بعد پانی سے دھلائی ہوتی تھی، اور ہائبرڈائزیشن سے پہلے SSPE میں پتلے SDS سے رنگ ہٹایا جا سکتا تھا۔

عام طور پر استعمال ہونے والا جدید متبادل یوں ہے:

1. RNA یا ساخت کھولے گئے DNA کو نائیلون یا نائٹروسیلولوز پر منتقل کریں، پھر UV کراس لنکنگ یا گرم کرنے سے تثبیت کریں تاکہ رنگ آمیزی کے دوران نمونہ ضائع نہ ہو۔
2. اختیاری مگر عام مرحلہ: جھلی کو تقریباً 15 منٹ 5 percent ایسیٹک ایسڈ میں گیلا کریں۔
3. pH 5.2 کے قریب 0.3 سے 0.5 M سوڈیم ایسیٹیٹ میں 0.02 سے 0.04 percent میتھیلین بلیو سے 5 سے 10 منٹ رنگ آمیزی کریں۔
4. پانی سے دھوئیں اور 5 سے 15 منٹ رنگ ہٹائیں، ریکارڈ بنائیں، پھر ہائبرڈائزیشن سے پہلے باقی رنگ نکال دیں۔

ناردرن کام میں مثبت بار والا نائیلون سب سے زیادہ استعمال ہوتا ہے۔ نائٹروسیلولوز بھی اسی ایسیٹک ایسڈ اور ایسیٹیٹ طریقے کے ساتھ کام کرتا ہے۔ تصویر کو منتقلی کی تصدیق، 28S اور 18S بینڈوں کے موازنے (یا بیکٹیریائی RNA کے لیے 23S اور 16S)، لیڈرز اور معیاری نمونوں کی نشان دہی، اور کل RNA کی تقریبی نارملائزیشن کا ریکارڈ رکھنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ شائع شدہ ناردرن طریقے لوڈنگ کی جانچ کے لیے رنگے ہوئے رائبوسومل بینڈوں کی مقداری پیمائش کرتے ہیں، جن میں ڈیری سائنس کی وہ تحقیق بھی شامل ہے جس نے نارملائزیشن کے لیے میتھیلین بلیو کے رائبوسومل بینڈ استعمال کیے۔ سدرن جھلیوں کو بھی اسی طرح دیکھا جا سکتا ہے، مگر یہ رنگ ناردرن میں لوڈنگ اور منتقلی کی جانچ کے طور پر کہیں زیادہ مستند ہے۔ سدرن میں DNA کی ساخت منتقلی سے پہلے کھولی جاتی ہے، اس لیے جیل کی حساسیت کے اعداد وہاں لاگو نہیں ہوتے۔

شناخت کی حدود اور پس منظر: نیلا رنگ کہاں پیچھے رہ جاتا ہے

نیچے دیا گیا موازنہ جان بوجھ کر تقریبی ہے۔ رنگ کی کارکردگی جیل کے فیصد، بینڈ کی چوڑائی، بصری نظام اور رنگ ہٹانے میں پابندی پر منحصر ہے۔ ہر عدد کو مقدار کے درجے کا اشارہ سمجھیں، متعین خصوصیت نہیں۔

پس منظر کا کنٹرول طے کرتا ہے کہ محدود سگنل قابلِ استعمال ہوگا یا نہیں۔ آزاد رنگ بہت گہرا ہوتا ہے، اس لیے تضاد غیر بندھے رنگ کو ہٹانے سے پیدا ہوتا ہے، مگر بندھا ہوا رنگ نہیں نکلنا چاہیے۔ زیادہ مرتکز رنگ شاذونادر ہی حساسیت بڑھاتا ہے۔ یہ بنیادی طور پر رنگ ہٹانے کا وقت بڑھاتا ہے۔ اسی جیل، جھلی اور کیمرے پر تخفیف کی ایک سلسلہ وار جانچ کریں، اور صرف وہ حد استعمال کریں جہاں مجموعی کثافت ڈالے گئے نمونے کی مقدار کے متناسب رہے۔ میتھیلین بلیو نیم مقداری لوڈنگ نارملائزیشن میں مدد دیتا ہے۔ یہ وسیع متحرک حد والا مقداری جانچ طریقہ نہیں، کیونکہ جھلی کی گنجائش، منتقلی کی کارکردگی، اشباع اور رنگ ہٹانے کی کیفیت ہر لین میں بدلتی ہے۔

مطابقت کی حدود: رنگ آمیزی کے بعد کیا برقرار رہتا ہے

نیلی رنگ آمیزی کے بعد کلوننگ کا مظاہرہ کیا جا چکا ہے۔ Flores اور ساتھیوں نے رنگے ہوئے ایگاروز بینڈ کاٹ کر نکالے، DNA بازیافت کیا، اسے لائیگیٹ کیا اور خلیوں میں منتقل کیا، اور UV کے ساتھ ایتھیڈیم برومائیڈ کے بعد ہونے والی کلوننگ کے مقابلے میں بہتر نتائج رپورٹ کیے۔ ممکنہ وجہ کم ضیائی نقصان ہے، خود رنگ کا کوئی فائدہ نہیں۔ سفید روشنی کی نمائش مختصر رکھیں اور بازیافت شدہ DNA کو معمول کی جیل استخراجی صفائی سے گزاریں۔

PCR اور سیکوینسنگ کے لیے شواہد کم ہیں۔ باقی رہ جانے والا رنگ نیوکلیک ایسڈز سے جڑتا ہے، اس لیے انزائمی مراحل سے پہلے رنگ ہٹائیں اور صفائی کریں۔ نیلی جیل سے درست طور پر صاف کیے گئے DNA کے کام کرنے کی توقع ہے، مگر مختلف پولیمریز اور سیکوینسنگ کیمیائی طریقوں میں رنگ کے براہِ راست ساتھ چلے آنے کی برداشت اچھی طرح مقداری طور پر متعین نہیں۔ اسے مفروضہ نہ بنائیں۔

بلاٹ ہائبرڈائزیشن اس وقت مطابقت رکھتی ہے جب ترتیب سختی سے قائم رہے: منتقلی، تثبیت، رنگ آمیزی، ریکارڈ بنانا، رنگ ہٹانا، ہائبرڈائزیشن۔ یہی Herrin اور Schmidt کی ترتیب ہے۔ منتقلی سے پہلے رنگ آمیزی کرنا، یا رنگ ہٹانے کا مرحلہ چھوڑنا، ایک مختلف طریقہ ہے اور اسے اپنی الگ توثیق درکار ہے۔ رنگ ہٹانے کے بعد معیاری پروب ہٹانا اور دوبارہ پروب لگانا معمول کے مطابق کیا جا سکتا ہے۔ اسی رنگ کے خاندان سے خلیاتی سطح پر رنگ آمیزی، اور اس بات کے لیے کہ تثبیت شدہ فلم کی منطق زندہ خلیوں کے طریقوں پر کیوں لاگو نہیں ہوتی، مائیکروسکوپی رنگ آمیزی کا اٹلس دیکھیے۔

بینڈ کاٹ کر نکالنا تیاری کے لیے ایگاروز اور نیلے رنگ سے تلاش کیے گئے PAGE اولیگوز دونوں میں کام کرتا ہے، بشرطیکہ مستقل تثبیت والا متبادل طریقہ استعمال نہ کیا جائے۔ رنگ ہٹانے کے بعد الیکٹروایلیوشن قابلِ واپسی بندھن بنانے والے رنگ کے لیے کیمیائی طور پر معقول ہے، مگر میتھیلین بلیو کے مخصوص، کنٹرول شدہ بازیافتی مقدار کے اعداد کم ہیں۔ اخراج کے بعد نمکیات ہٹائیں یا ترسیب کریں۔

بار بار سامنے آنے والی ناکامیاں

مدھم جیل بینڈ عموماً بتاتے ہیں کہ رنگ کی بنیاد پر مشاہدے کے لیے مادّے کی مقدار بہت کم ہے، خاص طور پر مختصر ایک دھاگے والے یا RNA اہداف کے لیے۔ زیادہ نمونہ ڈالیں، تازہ رنگ استعمال کریں، ارتکاز بڑھانے سے پہلے رنگ آمیزی کا دورانیہ بڑھائیں، اور رنگ ہٹانا پہلے روک دیں۔ تضاد کے بغیر پوری نیلی جیل عموماً حد سے زیادہ رنگ آمیزی یا پانی بہت کم بار بدلنے کی علامت ہے۔ PAGE بینڈوں کا مدھم ہونا متوقع کیمیائی رویہ ہے، ناکام رنگ آمیزی نہیں۔ جلد تصویر لیں۔ جھلی کا غیر یکساں پس منظر تہوں، بلبلوں، انگلیوں کے نشانات، غیر یکساں ہلانے یا جگہ جگہ نامکمل منتقلی کی طرف اشارہ کرتا ہے۔ ہائبرڈائزیشن کنٹرول کے بغیر اسے غیر مساوی لوڈنگ نہ سمجھیں۔ پھیلا ہوا، کمزور رائبوسومل نمونہ ٹوٹ پھوٹ کی علامت ہو سکتا ہے، مگر اس کی وجہ نامکمل منتقلی، کل RNA کی بہت کم مقدار (عام لینوں میں کئی سے دسیوں مائیکروگرام ہوتے ہیں)، یا حد سے زیادہ رنگ ہٹانا بھی ہو سکتی ہے۔ رنگ وافر رائبوسومل RNA کو ظاہر کرتا ہے۔ یہ کسی مخصوص ٹرانسکرپٹ کو ظاہر نہیں کرتا۔ یہ کام پروب کا ہے۔

مبالغے کے بغیر حفاظت اور ہینڈلنگ

میتھیلین بلیو کو سنبھالنا ایتھیڈیم برومائیڈ کے مقابلے میں آسان ہے، مگر یہ بے ضرر نہیں۔ MilliporeSigma کی موجودہ حفاظتی ڈیٹا شیٹ رنگ کو منہ کے راستے شدید زہریلے اثر کی Category 4 میں رکھتی ہے، یعنی نگلنے پر نقصان دہ، اور Sigma-Aldrich کی میتھیلین بلیو SDS کے مطابق اسے منظور شدہ فضلہ تلفی کے طریقے سے ٹھکانے لگانا چاہیے۔ ایتھیڈیم برومائیڈ کے ساتھ جینیاتی مادّے کو نقصان پہنچانے کی زیادہ سخت تنبیہات ہیں، جن میں اس کی Sigma-Aldrich ایتھیڈیم برومائیڈ SDS میں تولیدی خلیوں پر مشتبہ اثرات بھی شامل ہیں۔ اس کی جیلوں اور محلولوں کو عموماً خطرناک کیمیائی فضلے کے طور پر الگ رکھا جاتا ہے، جیسا کہ Thermo Fisher کے نیوکلیک ایسڈ رنگوں کے رہنما میں درج ہے۔ دونوں کے لیے SDS اور ادارے کے قواعد پر عمل کریں۔ خشک رنگ کو مضبوطی سے بند اور خشک رکھیں، استعمال کے لیے تیار رنگ کو صرف طریقۂ کار کی اجازت کے مطابق دوبارہ استعمال کریں، رنگی ہوئی جھلیوں کو فلٹر شیٹوں کے درمیان خشک حالت میں محفوظ رکھیں، اور بینڈ پھیل کر غائب ہونے سے پہلے جیلوں کی تصویر لیں۔

لیبارٹری کی بنیادی بات یاد رکھیں۔ جیلیں سفید روشنی میں زیادہ مقدار والے نمونے کی نظر آنے کی صلاحیت جانچتی ہیں۔ جھلیاں پروب کے حساس کام سے پہلے منتقلی اور لوڈنگ جانچتی ہیں۔ ایک ہی رنگ دونوں کام کرتا ہے، محدود حساسیت، قابلِ واپسی بندھن اور مراحل کی سخت ترتیب کے ساتھ۔