Метиленовий синій і ATP: чи означає більше споживання кисню більше енергії?

Ізольована мітохондрія перебуває в камері з паливом, але без ADP. Вона повільно споживає кисень. Додавання ADP збільшує споживання кисню в кілька разів. Коли ADP вичерпується, споживання кисню знову знижується. Паливо не змінювалося. Змінювалася лише потреба в ATP.

У цій короткій послідовності — вся відмінність, про яку йдеться в статті. Споживання кисню показує, як швидко електрони проходять дихальним ланцюгом до кисню. Утворення ATP показує, яка частка цього потоку перетворюється на придатну до використання енергію. Ці процеси мають спільну проміжну ланку — протонний градієнт на внутрішній мембрані мітохондрії. Усе, що змінює ступінь спряження цього градієнта із синтезом ATP, може змінювати два кінцеві показники в різних напрямках. Метиленовий синій тут є наочним прикладом, адже для нього спостерігали обидва варіанти: в одних препаратах він підвищував споживання кисню разом з ATP, а в інших — підвищував споживання кисню, тоді як ATP залишався на тому самому рівні або знижувався.

Читачі, які спершу хочуть побачити загальну картину перенесення електронів, можуть почати з пояснення того, як метиленовий синій переносить електрони дихальним ланцюгом. А ті, кому потрібна термінологія ранніх експериментів із киснем, можуть прочитати, що насправді показали перші вимірювання дихання.

Дихання, ATP і градієнт між ними

Електрони від NADH і FADH2 надходять у ланцюг через комплекси I та II, проходять через комплекс III до цитохрому c, а потім через комплекс IV — до кисню. Енергія, що вивільняється в комплексах I, III та IV, забезпечує перекачування протонів із матриксу в міжмембранний простір. Ця різниця заряду та кислотності створює протонорушійну силу, а її електрична складова — мембранний потенціал — зазвичай переважає.

ATP-синтаза пропускає протони назад у матрикс і використовує вивільнену енергію для сполучення ADP із фосфатом з утворенням ATP. Отже, послідовність така:

споживання кисню, потім перекачування протонів, потім градієнт, потім синтез ATP.

Проблема в тому, що протони можуть повертатися й іншими шляхами. Будь-яке повернення в обхід ATP-синтази є витоком протонів. Щоб підтримувати сталий мембранний потенціал, через цей витік ланцюг мусить знову перекачувати ті самі протони. Це збільшує споживання кисню без додаткового утворення ATP. Достатньо сильний витік означає роз'єднання: споживання кисню зростає, тоді як ATP залишається на тому самому рівні або знижується, а втрачена енергія розсіюється як тепло.

Стан 3, стан 4 і коефіцієнт дихального контролю

Класична термінологія походить із досліджень ізольованих мітохондрій. Стан 3 — це дихання за наявності субстрату та ADP: ATP-синтаза зменшує градієнт, мембранний потенціал дещо знижується, ланцюг прискорюється, щоб відновити його, а споживання кисню є високим, оскільки утворюється ATP. Стан 4 — це дихання після вичерпання ADP: ATP-синтаза простоює, градієнт зростає, високий мембранний потенціал протидіє подальшому перекачуванню, і споживання кисню знижується до рівня, потрібного для компенсації витоку.

Отже, коефіцієнт дихального контролю — відношення дихання у стані 3 до дихання у стані 4 — показує ступінь спряження в препараті. Високий коефіцієнт означає, що ADP сильно контролює дихання. Зниження коефіцієнта разом зі зростанням дихання у стані 4 означає, що витік починає переважати. Саме в цьому контексті стають зрозумілими наведені нижче результати досліджень метиленового синього.

Варто пам'ятати одну уявну модель. Високий мембранний потенціал сповільнює ланцюг. Розсіювання потенціалу прискорює його. Ланцюг реагує на те, наскільки важко стало перекачувати протони, а не безпосередньо на те, чи утворюється ATP.

Коли кінцеві показники змінюються разом

Найнаочніший приклад спряження отримано в ізольованих мітохондріях мозку морських свинок із заблокованими дихальними комплексами. За концентрацій метиленового синього від 100 наномолярів до 1 мікромоляра споживання кисню в стані спокою зростало, коли паливом слугували глутамат із малатом, сукцинат або гліцерофосфат, тоді як стимульоване ADP дихання не змінювалося. У мітохондріях із токсично заблокованим комплексом I або комплексом III барвник помірно підвищував утворення ATP, відновлював мембранний потенціал і поліпшував поглинання кальцію. Запропонований шлях є обхідним: барвник приймає електрони перед місцем блокування та передає їх цитохрому c, оминаючи пошкоджений комплекс.

Другий випадок узгоджених змін спирається на зовсім інше джерело ATP. В ізольованих мітохондріях мозку з пригніченою ATP-синтазою метиленовий синій усе одно стимулював дихання на кожному дослідженому субстраті. Проте синтез ATP зростав лише на альфа-кетоглутараті та глутаматі — двох субстратах, з яких утворюється сукциніл-CoA. Коли олігоміцин блокував ATP-синтазу, додатковий ATP утворювався завдяки субстратному фосфорилюванню за участю сукциніл-CoA-лігази в циклі лимонної кислоти, а не завдяки окисному фосфорилюванню. Барвник також відновлював мембранний потенціал за одночасного пригнічення комплексу I та ATP-синтази. Тут споживання кисню й ATP змінювалися разом, але лише тоді, коли субстрат уможливлював другий шлях утворення ATP. На сукцинаті або малаті дихання зростало без додаткового ATP. Той самий барвник, та сама камера, інше паливо — інший результат.

Коли кінцеві показники розходяться

Випадки розходження так само опубліковані й не менш повчальні. У дослідженні ізольованих мітохондрій печінки щурів 1997 року метиленовий синій прискорював дихання у стані 4 в мітохондріях із високим ступенем спряження, що дихали на сукцинаті. Це знижувало коефіцієнт дихального контролю. Ефект був помітний від 0.5 мікромоляра й виражений за 5 мікромолярів — концентрації, близької до рівнів у плазмі після внутрішньовенного болюсного введення 100 міліграмів. За 5 мікромолярів мітохондрії також набухали, хоча порушення спряження спочатку з'являлося за нижчих концентрацій. Це свідчить, що витік передував структурному пошкодженню, а не виникав унаслідок нього. У роз'єднаних мітохондріях барвник стимулював дихання залежно від концентрації, з досягненням насичення. Споживання кисню зростало в обох препаратах. Синтез ATP на одиницю спожитого кисню — ні. Це класичне поєднання роз'єднання та перенесення електронів в одній молекулі.

Найвиразніше розходження спостерігали в сітківці. У мишей із дефіцитом AIF і фоторецепторних клітинах, оброблених ротеноном, метиленовий синій зберігав товщину сітківки, маркери фоторецепторів і структуру мітохондрій, а також знижував відношення NADH до NAD та пригнічував шляхи стресової відповіді, зокрема відповідь на незгорнуті білки й мітофагію. При цьому він не усував дефіцит ATP. Захист без відновлення енергозабезпечення означає, що позитивний ефект реалізувався через окисно-відновний баланс і цілісність мітохондрій, а не через додатковий ATP. Той, хто прирівняв би виживання тканини до відновлення вироблення енергії, цілком неправильно витлумачив би цей експеримент.

Дослідження мітохондрій мозку додає до цього балансу й витрати. Ті самі низькі концентрації, які поліпшували біоенергетику, також підвищували утворення перекису водню за всіх досліджених умов і сповільнювали його усунення. Це вимірювали каліброваним аналізом Amplex, а не неспецифічним барвником. Більше ATP і більше окисника з'являлися разом.

Практичний перелік запитань для читання

Чотири запитання допомагають відрізнити результат зі збереженим спряженням від результату з роз'єднанням.

По-перше, який кінцевий показник насправді вимірювали. Саме лише споживання кисню не може показати рівень ATP. Синтез ATP, мембранний потенціал і коефіцієнт дихального контролю додають по одному елементу інформації, недоступному кисневому електроду. Посібник із читання тверджень у дослідженнях метиленового синього докладно пояснює цей підхід до кінцевих показників.

По-друге, який субстрат живив мітохондрії. Результат із сукциніл-CoA показує, що вибір палива може визначати, чи здатне додаткове дихання взагалі забезпечити додатковий ATP.

По-третє, яку концентрацію використовували. Метиленовий синій у наномолярних і низьких мікромолярних концентраціях у мітохондріях мозку давав помірне поліпшення біоенергетики ціною збільшення утворення окисника; у мітохондріях печінки концентрації від половини мікромоляра послаблювали спряження; за 5 мікромолярів додавалося набухання. Концентрація — частина механізму, а не другорядна деталь.

По-четверте, на якій моделі отримали результат. Ізольовані мітохондрії розкривають схему роботи, але в цілих клітинах і тканинах додаються транспорт, відновлення до безбарвної форми та конкуруючі шляхи відведення електронів. Лабораторні дослідження дозування, зокрема того, як концентрація та протокол визначають ефекти метиленового синього, є містком між показниками в камері та будь-яким твердженням про людину.

Споживання кисню відображає потік електронів. ATP показує, яка частка цього потоку була перетворена на запас енергії. Метиленовий синій може змінювати будь-який із цих показників, і наведені експерименти демонструють усі чотири можливі поєднання: обидва зростають; дихання зростає, а приріст ATP залежить від субстрату; дихання зростає, тоді як спряження слабшає; тканина зберігається, тоді як ATP залишається на тому самому рівні. Показник кисневого електрода — початок інтерпретації, а не її завершення.