Метиленовий синій у дослідженнях інсульту та церебральної гіпоперфузії: що насправді показують три моделі

Закупорена артерія, культура клітин без поживних речовин і щур зі звуженими артеріями шиї звучать як три варіанти одного експерименту. Але це не так. Кожен ставить окреме запитання, і метиленовий синій у кожному дає іншу відповідь. Якщо їх змішувати, наукові публікації здаються суперечливими. Якщо розглядати окремо, проявляється чітка закономірність, яку переважно визначає час застосування.

Саме це розмежування і є головною метою огляду. Три моделі — це гострий вогнищевий інсульт, киснево-глюкозна депривація з реоксигенацією в культурі клітин і хронічна церебральна гіпоперфузія протягом тижнів. Запропонований механізм, що їх пов’язує, стосується мітохондрій, але результати різняться, оскільки різняться метаболічні умови.

Три моделі відповідають на різні запитання

Гострий вогнищевий інсульт у щурів зазвичай спричиняють оклюзією середньої мозкової артерії, скорочено MCAO. Закупорка, подібна до тромбу, створює ішемічне ядро, оточене пенумброю — тканиною, яка перебуває під загрозою, але потенційно може бути врятована, якщо кровотік відновиться. Тут запитання полягає в тому, чи сповільнює втручання збільшення зони інфаркту або чи зберігає функцію в період реперфузії.

Киснево-глюкозна депривація, скорочено OGD, працює на зовсім іншому рівні. Культивовані клітини мозку поміщають в умови майже повної відсутності кисню та без глюкози, а потім повертають у звичайне середовище. Тут немає тромбу, колатерального кровообігу, артеріального тиску чи імунної системи. Запитання суто клітинне: що відбувається з диханням, АТФ і виживанням, коли субстрати зникають, а потім знову стають доступними.

Для моделювання хронічної церебральної гіпоперфузії використовують постійну двобічну оклюзію сонних артерій у щурів — так звану модель 2VO. Кровотік у передньому мозку знижується і залишається низьким протягом тижнів. Тут немає раптового вогнищевого інфаркту чи екстреної реперфузії. Запитання полягає в тому, чи зберігає метаболічна підтримка протягом тижнів судини, мітохондрії та пам’ять за тривалого зниження кровотоку.

Тому поліпшення пам’яті після одного місяця лікування в моделі 2VO безпосередньо нічого не говорить про порятунок мозку людини під час екстреної тромбектомії. Це розмежування важливе, адже більшість оптимістичних оглядів його оминає.

Гострий інсульт: захист під час реперфузії, відтермінування без неї

Найчіткіший результат у гострій моделі отримано при тимчасовій MCAO з реперфузією. У щурів оклюзія тривала 60 хвилин, після чого їм починали внутрішньовенно вводити метиленовий синій у низькій дозі в момент реперфузії, з подальшими дозами через 3 години та на 2-й день. МРТ показала, що до 2-го дня в групі, яка отримувала розчинник, зона ураження збільшилася приблизно на 19 відсотків, тоді як у групі лікування вона зменшилася приблизно на 17 відсотків. Кінцеві зони інфаркту були приблизно на 30 відсотків меншими, а неврологічні показники — кращими на 2-й і 7-й день. За даними візуалізації, збереження тканини покращилося як у ядрі, так і в пенумбрі. Ширша література про нейропротекцію розглядає цей захист, пов’язаний із часом реперфузії, поряд із результатами досліджень глобальної ішемії та травми.

Картина змінюється, коли артерія залишається закупореною. В експерименті з постійною MCAO метиленовий синій, введений під час тривалої ішемії, сповільнював розширення зони ураження на дифузійних зображеннях і ненадовго подовжував перфузійно-дифузійну невідповідність, дещо покращуючи локальний кровотік. Однак кінцевий об’єм інфаркту через 24 години істотно не відрізнявся. Він відтерміновував перехід тканини під загрозою в інфаркт, але не замінював відновлення прохідності судини.

Третє дослідження гострої моделі додає нюанси щодо механізму та дози. Одноразове внутрішньоочеревинне введення відразу після оклюзії дало найбільше зменшення зони інфаркту, приблизно на 50 відсотків, за проміжної дози 5 mg/kg, а не за 1 чи 10 mg/kg, разом із кращими сенсомоторними показниками. Автори пов’язали це зі збереженням структури мітохондрій і посиленням мітофагії — вибіркового видалення пошкоджених мітохондрій. Отже, доза, шлях введення та схема застосування мають значення, а значення mg/kg для щурів не є дозами для лікування інсульту в людей.

Культура клітин: той самий препарат допомагає або шкодить залежно від часу застосування

Експеримент з астроцитами є найпоказовішим, і саме його найчастіше цитують неправильно. Первинні астроцити кори головного мозку миші протягом 6 годин зазнавали тяжкої депривації за 0.1 відсотка кисню в середовищі без глюкози, пірувату чи сироватки. Після цього проводили 24 години реоксигенації з відновленням доступності субстратів. Приблизно половина клітин загинула, тож методика давала змогу виявити ефект в обох напрямках.

Коли метиленовий синій був присутній під час фази депривації, виживання погіршувалося, а не покращувалося. Коли ж його додавали під час реоксигенації, низькі мікромолярні концентрації покращували життєздатність і підвищували споживання кисню, поглинання глюкози та вироблення АТФ. За нормальних умов ті самі концентрації збільшували поглинання глюкози приблизно на 89 відсотків за 0.1 мікромоляра та приблизно на 200 відсотків за 1 мікромоляра. Після ушкодження зберігалися глікоген і активність гексокінази, а вимірюваного зростання рівня супероксиду не спостерігали.

Механізм легше зрозуміти через аналогію з резервним генератором. Метиленовий синій діє як альтернативний переносник електронів, який приймає відновні еквіваленти та передає їх у напрямку цитохрому c і комплексу IV. Це підтримує потік електронів і синтез АТФ, водночас зменшуючи витік електронів на попередніх етапах. Під час тяжкої депривації така стимуляція стає недоліком, оскільки підвищує метаболічні потреби, коли кисень і глюкоза майже відсутні, що може швидше виснажити останні резерви. Після відновлення доступності субстратів та сама властивість стає перевагою, адже допомагає пошкодженим мітохондріям ефективно використовувати знову доступні кисень і глюкозу. Саме тому висновки з пояснень мітохондріального перенесення електронів потрібно розглядати з урахуванням умов депривації.

Одне застереження: це правило щодо часу застосування стосується саме цієї моделі астроцитів. У супутньому клітинному дослідженні з іншим типом клітин, м’якшою депривацією та нижчою концентрацією захисний ефект виявили навіть за застосування під час депривації. Тип клітин, залишковий кисень, концентрація та протокол визначають напрямок ефекту.

Хронічне зниження кровотоку: пам’ять, цитохромоксидаза та судини протягом тижнів

У хронічних експериментах застосовували щоденне лікування низькими дозами протягом тижнів, а не одноразове екстрене болюсне введення. У першому дослідженні щури з постійною оклюзією сонних артерій отримували 4 mg/kg щодня протягом одного місяця. Препарат вводили після кожного щоденного тренування, щоб впливати на консолідацію пам’яті, а не на безпосереднє виконання завдання. Тварини з оклюзією повільніше опановували завдання на зорове розрізнення та гірше виконували складний тест на пам’ять, тоді як здатність плавати, рухова активність і розпізнавання запахів не змінювалися. Щоденне лікування послаблювало порушення навчання та пам’яті, не змінюючи загальної рухової поведінки.

У подальшому дослідженні після тієї самої місячної схеми визначали активність цитохромоксидази, тобто мітохондріального комплексу IV, у 44 ділянках мозку. Оклюзія знижувала активність ферменту в зоровій, префронтальній і периринальній корі, а також у гіпокампі та мигдалеподібному тілі, і послаблювала узгодженість активності зорової кори та гіпокампа. Лікування зберігало регіональну активність ферменту та посилювало ці міжрегіональні метаболічні кореляції, а збережена активність корелювала з кращим виконанням завдань. Ці кореляції описують узгоджену активність метаболічного ферменту, а не прямі вимірювання функціональної зв’язності мозку людини — розмежування, яке допомагають зберегти огляди енергетичного метаболізму мозку.

В окремому тижневому дослідженні застосовували 2 mg/kg щодня та додавали інгібітор сигнального шляху для перевірки механізму. За лікування церебральний кровотік зріс приблизно з 60 до 100 mL на 100 g за хвилину, а судинна щільність у гіпокампі — приблизно з 15.1 до 23 відсотків. Обидва покращення частково нівелювалися при блокуванні шляху клітинного виживання PI3K/Akt, а рівень фосфорильованого Akt підвищувався за лікування. Результати щодо кровотоку, судинної щільності, бар’єра та нейронів вказують на нейроваскулярний захист, пов’язаний із сигналізацією PI3K/Akt, а не на суто метаболічний ефект.

Чому все це не рівнозначне невідкладній допомозі при інсульті

Контрольовані лабораторні умови — причина, через яку ці результати не можна переносити безпосередньо. У культивованих клітин немає тромбу чи фармакокінетики. Модель 2VO — це тривале глобальне зниження кровотоку, а не раптова вогнищева емболія з пенумброю, що виникла кілька хвилин тому. Навіть у щурячій моделі MCAO використовують молодих здорових тварин, анестезію, однакові оклюзії та введення препарату в точно визначений час. Це відрізняється від ситуації з літніми пацієнтами, які мають різні тромби, атеросклероз, гіпертензію, діабет і невідомий час початку симптомів.

Жодне опубліковане рандомізоване дослідження за участю людей не встановило, що метиленовий синій є засобом невідкладного лікування гострого ішемічного інсульту. У дослідженні нейровізуалізації за участю людей, яке іноді цитують, брали участь 26 здорових дорослих, а не пацієнти з інсультом. Одноразова пероральна доза змінювала пов’язані з виконанням завдань сигнали мозку та давала невелике покращення відтворення інформації з пам’яті. Це свідчить про дію на центральну нервову систему, а не про ефективність при інсульті. Натомість чинні рекомендації з невідкладної допомоги зосереджені на швидкій реперфузії за допомогою внутрішньовенного тромболізису в пацієнтів, які відповідають критеріям, і тромбектомії при відповідних оклюзіях великих судин. Стандартні алгоритми невідкладної допомоги при інсульті залишаються єдиним доведеним шляхом. За підозри на інсульт ніколи не можна затримувати допомогу заради введення метиленового синього, а практичні обмеження екстраполяції доклінічних доз пояснюють, чому схеми для щурів не можна трактувати як клінічні схеми лікування.

Дані щодо безпеки додатково підкреслюють цю межу. Для внутрішньовенного метиленового синього передбачене попередження в рамці про серйозний або смертельний серотоніновий синдром при поєднанні із серотонінергічними препаратами, зокрема СІЗЗС, СІЗЗСН та інгібіторами МАО, які приймає багато пацієнтів вікових груп із ризиком інсульту. Він протипоказаний при дефіциті G6PD через ризик гемолізу. Він також пригнічує сигналізацію оксиду азоту, що за певних умов підвищує судинний опір і тиск, тому його не слід описувати просто як препарат, що збільшує кровотік у мозку. Затверджена схема внутрішньовенного введення 1 mg/kg при набутій метгемоглобінемії не є схемою лікування інсульту.

Чесний підсумок має вузькі межі, але спирається на реальні результати. У період реперфузії при тимчасовій вогнищевій ішемії метиленовий синій у низькій дозі зменшував прогресування ураження у щурів. За постійної оклюзії він відтерміновував інфаркт, але не запобігав йому. В астроцитах він шкодив під час тяжкої депривації та допомагав під час реоксигенації. За хронічної гіпоперфузії він зберігав цитохромоксидазу, судини та пам’ять протягом тижнів. Один переносник, три контексти, три відповіді.