Метиленовий синій і Bartonella: лабораторні результати та межі клінічних доказів

Культуральний посуд і пацієнта об’єднує слово «інфекція», але не саме поняття. У посуді інфекція — це кількість колоній на агарі. У пацієнта — це бактерії всередині клітин і судин, препарати, що переміщуються через кров і тканини, та імунна система, яка виконує частину роботи. Якщо змішати ці два поняття, разючий лабораторний показник починає здаватися лікуванням. Якщо розглядати їх окремо, той самий показник залишається тим, чим він є: підставою для наступного експерименту.

Саме це розмежування — головне завдання цього огляду метиленового синього й Bartonella. У двох лабораторних дослідженнях однієї дослідницької групи метиленовий синій перевіряли проти Bartonella henselae у станах без росту. Обидва дослідження повідомили про високу активність у скляному та пластиковому лабораторному посуді. Жодне не передбачало випробувань на людях.

Чому дослідники вивчають стаціонарну фазу

Більшість випробувань антибіотиків проводять на клітинах, що ростуть. Така модель не охоплює складнішого випадку: клітин, які припинили ділитися й витримують дію препаратів, що знищують їхніх споріднених клітин у фазі росту.

Bartonella може зберігатися в організмі, зокрема всередині еритроцитів та ендотеліальних клітин. Тому група з’ясовувала, які схвалені препарати можуть знищувати B. henselae після переходу в стаціонарну фазу. Низька мінімальна інгібувальна концентрація (MIC) для клітин, що ростуть, не передбачала знищення клітин у стаціонарній фазі. Рифампіцин мав дуже низьку MIC, проте погано знищував стаціонарні клітини, тоді як сполуки з вищими значеннями MIC знищували їх добре. Читачі, яким потрібен загальний підхід до аналізу таких статей, знайдуть його в посібнику з читання досліджень метиленового синього.

Перший скринінг: Li та колеги, 2019

У скринінгу стаціонарної фази 2019 року в Antibiotics використовували один штам, B. henselae JK53, вирощений у середовищі Шнайдера з 10 відсотками фетальної бичачої сироватки за температури 37 C і 5 відсотків CO2. Одноденні культури складалися переважно з розсіяних клітин, що ділилися. П’ятиденні культури з приблизно 10 у 8-му степені колонієутворювальних одиниць на mL вважали стаціонарними; вони містили видимі агрегати.

Для аналізу використовували SYBR Green I з йодидом пропідію, калібровані за сумішами живих клітин і клітин, знищених ізопропанолом. Оскільки метиленовий синій має інтенсивне забарвлення, попередні позитивні результати підтверджували мікроскопією, а потім підрахунком колоній на кров’яному агарі — суворішим кінцевим показником.

Серед 1,581 схваленого препарату, перевіреного за концентрації 50 мікромолярів, метиленовий синій залишав 16 відсотків життєздатних клітин за даними планшетного рідера та 25 відсотків за даними мікроскопії. Для даптоміцину цей показник становив 21 відсоток, для кількох азолів — від 22 до 27 відсотків, для гентаміцину — 32 відсотки, для еритроміцину — 66 відсотків, для ципрофлоксацину — 74 відсотки. Памоат пірвінію виглядав активнішим за даними рідера, але оцінити його мікроскопією не вдалося через його власну флуоресценцію.

Для B. henselae, що росте, MIC метиленового синього становила від 0.08 до 0.16 мікрограма на mL. Для п’ятиденних стаціонарних клітин за концентрації 5 мікрограмів на mL після одного дня впливу кількість колоній зменшилася до рівня, за якого їх не виявляли, як і для даптоміцину та памоату пірвінію за перевірених концентрацій. В окремому експерименті з оцінювання знищення клітин у часі використовували 10 мікрограмів на mL. Це лабораторні рівні експозиції, а не дози, і в статті їх саме так і подано. Наведене в статті пікове значення концентрації в плазмі людини, близьке до 3.9 мікрограма на mL, слугує лише довідковим контекстом. Огляд фармакокінетики метиленового синього пояснює, чому показник у плазмі не можна трактувати як показник у тканинах.

У статті прямо зазначено два обмеження. Не було моделі біоплівки та перевірки комбінацій із метиленовим синім. П’ятиденні агрегати були скупченнями у стаціонарній рідкій культурі, а не валідованим експериментом із біоплівкою. Автори закликали до досліджень на тваринах, досліджень комбінацій і біоплівок, а також перевірки на інших видах Bartonella.

Комбінації та клітини з біоплівки: Zheng та колеги, 2020

У подальшому дослідженні 2020 року в BMC Microbiology зберегли той самий штам і середовище, але перейшли до шестиденних стаціонарних культур і додали два компоненти, яких бракувало першій роботі: комбінації з двох препаратів та модель клітин, отриманих із біоплівки.

При застосуванні окремих препаратів в однаковій концентрації 5 мікрограмів на mL протягом 24 годин метиленовий синій залишав 3.2 × 10 у 4-му степені колонієутворювальних одиниць на mL проти приблизно 2.8 × 10 у 10-му степені в контролі. Ципрофлоксацин, гентаміцин і нітрофурантоїн на той самий момент залишали менше колоній. Це відрізняється від результату 2019 року, коли за тієї самої номінальної концентрації після одного дня колоній не виявляли. Вік, щільність і обробка культур відрізнялися, тому ефект знищення відтворювався за напрямом, але не був однаковим за величиною. Така мінливість між експериментами — одна з причин, чому стандартні перевірки безпеки та взаємодій розглядають лабораторну активність окремо від клінічного ефекту.

Скринінг комбінацій — найчастіше цитована частина роботи. Концентрацію кожного компонента фіксували на рівні 5 мікрограмів на mL. І азитроміцин із метиленовим синім, і рифампіцин із метиленовим синім через 24 години не залишали виявлюваних колоній стаціонарної фази, як і обидві пари з ципрофлоксацином. Серед 25 перевірених пар такий результат дали лише ці чотири. Формального аналізу синергії не проводили, тому коректний термін — активна комбінація за цих умов, а не доведена синергія.

В експерименті з біоплівкою перевіряли клітини, отримані з молодої зруйнованої біоплівки, а не проникнення в неушкоджену зрілу біоплівку. Культури вирощували п’ять днів, розводили й переносили в лунки планшетів ще на п’ять днів, підтверджували наявність біоплівки забарвленням кристалічним фіолетовим, а потім зіскрібали перед впливом препаратів. За концентрації 5 мікрограмів на mL при застосуванні лише метиленового синього кількість колонієутворювальних одиниць до дня 6 зменшилася до 2.3 × 10 у 2-му степені — одного з найкращих результатів серед окремих препаратів, але не до нуля. Обидві комбінації з метиленовим синім досягли нуля до дня 6, як і обидві комбінації з ципрофлоксацином.

Автори відзначили ті самі обмеження, які помітив би уважний читач: молода зіскрібана біоплівка замість старої неушкодженої; одна зручна концентрація для всіх препаратів замість реалістичної пікової концентрації для кожного; лише вибрані пари з азитроміцином або рифампіцином; один штам; відсутність тварин і пацієнтів. Подальші дослідження комбінацій із трьох препаратів були запропоновані, але їхніх результатів не наведено.

Порівняння дизайну досліджень

Таблиця стисло передає головну думку цієї статті. Усе ліворуч від останнього стовпця — робота з культурами. Жодні дані з обох статей не належать до останнього стовпця.

Bartonella — не Borrelia

В обох статтях згадується Borrelia burgdorferi, спірохета, що спричиняє хворобу Лайма, оскільки аналіз із барвниками походить із попередніх досліджень стаціонарної фази Borrelia в тій самій лабораторії, де метиленовий синій і даптоміцин також показали активність. Ця історія — корисний контекст і поширене джерело помилок.

Жоден експеримент в обох статтях про Bartonella не перевіряє Borrelia паралельно з Bartonella. Мікроорганізми різні, середовища різні, концентрації різні, а припущений вплив метиленового синього на мембрану Bartonella був поданий як гіпотеза, що потребує подальшого вивчення. Результати не слід переносити між видами, і жодна зі статей не підтверджує широких тверджень про паразитів. Саме тому порівняння клітин-персистерів Borrelia та Bartonella розглядає ці два масиви літератури окремо.

Чому результати на культурах не перетворюються на протокол

Пошуковий інтерес до протоколу застосування метиленового синього проти Bartonella зрозумілий. Саме ці статті пояснюють, чому такий вислів слід сприймати як застереження, а не як список покупок.

По-перше, 5 мікрограмів на mL у лунці — не призначення. За цим значенням не стоять дані про всмоктування, розподіл, зв’язування з білками, проникнення всередину клітин або переносимість. Автори обрали його як приблизне середнє пікових концентрацій антибіотиків і зазначили, що в майбутніх дослідженнях слід використовувати реалістичну концентрацію для кожного препарату.

По-друге, нуль колоній означає відсутність колоній за цих умов висівання, а не стерильну тканину. Клітини-персистери, внутрішньоклітинні бактерії та обмеження відбору зразків залишаються поза межами агарової чашки.

По-третє, комбінації, що стерилізують вміст лунки, можуть не спрацювати або завдати шкоди в організмі. Азитроміцин із метиленовим синім і рифампіцин із метиленовим синім — лабораторні пари за лабораторних рівнів експозиції. Без фармакокінетичних досліджень на тваринах і контрольованих даних за участю людей немає ні визначеної дози, ні тривалості, ні співвідношення користі та ризику. Кожному, хто зважує варіанти, варто обговорити їх із лікарем і ознайомитися з тим, коли застосування метиленового синього потребує медичного нагляду, перш ніж робити будь-які висновки з даних, отриманих у посуді.

Вузький висновок, який ці статті справді підтверджують, такий: метиленовий синій має відтворювану активність проти B. henselae JK53 у стані без росту in vitro, зокрема в лабораторних комбінаціях із двох препаратів; найвиразніші результати для комбінацій і клітин із біоплівки отримано в дослідженні 2020 року. Усе інше, зокрема те, чи має ця активність значення для бартонельозу в людей, залишається неперевіреним.