Метилен зәңгәре белән чүпрә тестлары: тере күзәнәкләрне санау һәм сулыш алу вакытын үлчәү

Лаборатория өстәлендә ике пробирка тора. Икесе дә зәңгәр. Берсендә микроскоп аша күренгән зәңгәр күзәнәкләр чүпрәнең үлгән булуын аңлата. Икенчесендә пробирканың зәңгәрдән төссезгә әйләнүе чүпрәнең тере булуын һәм сулыш алуын күрсәтә. Буягыч бер үк, нәтиҗәләрнең мәгънәсе капма-каршы. Бу ике тестны бутасагыз, барлык нәтиҗәләр кирегә әйләнә.

Бу аерма — бөтен мәкаләнең асылы. Метилен зәңгәре — оксидлашу-кайтарылу буягычы: оксидлашкан хәлдә ул зәңгәр, кайтарылган хәлдә — төссез лейкометилен зәңгәре. Яшәүгә сәләтлелекне санау бу химик үзлекне микроскоп аша кыска вакытлы күзәтүдә куллана. Сулыш алу тәҗрибәсе исә аны бөтен катнашмада вакыт буенча күзәтелә торган реакциядә куллана. Һәркайсына үз протоколы, үз контроль үрнәкләре һәм нәтиҗәләргә үзенчә тәнкыйди караш кирәк.

Яшәүгә сәләтлелекне санау: кыска вакытка буяу һәм кичекмичә бәяләү

Сыра кайнатуда кулланыла торган протокол — иң стандартлаштырылган вариант. 2% натрий цитратында 0.01% w/v метилен зәңгәре әзерләгез, аны чүпрә суспензиясе белән 1:1 нисбәтендә кушыгыз һәм катнашманы алдан билгеләнгән кыска вакыттан соң карагыз. Басылып чыккан протоколларда бу вакыт Brewing Science Institute кулланмасындагы 1–2 минуттан алып тикшеренү протоколларындагы якынча 5 минутка кадәр үзгәрә; OIV шәраб микробиологиясе ысулы исә 10 минут эчендә карауны таләп итә. Санау катнашмасында буягыч концентрациясе якынча 0.005% була. Камилләштерелгән Neubauer камерасын тутырыгыз һәм якынча 400x зурайтуда куе зәңгәр күзәнәкләрне яшәүгә сәләтсез, буялмаганнарын яшәүгә сәләтле дип бәяләгез. OIV ысулында ачык зәңгәр күзәнәкләр тере дип санала; бу инде түбәндә каралачак субъективлык проблемасына ишарәли.

Күзәнәкләр концентрациясе камера геометриясеннән исәпләнә. Үзәктәге 1 mm яклы квадрат тулысынча саналганда, mL саен күзәнәкләр саны N тапкыр сыекландыру коэффициенты тапкыр 10^4 була; монда N — шул мәйдандагы күзәнәкләр саны. Бу ASBC чүпрә ысулларында тасвирланган. Яшәүгә сәләтлелекне исәпләү гадирәк: буялмаган күзәнәкләр санын барлык күзәнәкләр санына бүлеп, 100 гә тапкырлагыз. FEMS сыра җитештерүдәге чагыштырма тикшеренүенә һәм OIV практикасына таянып, яшәүгә сәләтлелекне бәяләү өчен якынча 400 күзәнәк санагыз. Чик сызыклары өчен бер үк кагыйдәне эзлекле кулланыгыз: мәсәлән, аскы һәм сул челтәр сызыкларындагы күзәнәкләрне кертегез, ә өске һәм уң сызыклардагы күзәнәкләрне кертмәгез.

Санау башланганчы ук бөреләр өчен кагыйдә билгеләргә кирәк. Киң таралган кагыйдә буенча, бөре ана күзәнәк зурлыгының якынча яртысына җиткәч, аерым күзәнәк итеп санала; аннан кечерәк булса, ана күзәнәк белән бергә санала. Нинди кагыйдә сайласагыз да, аны һәр квадратта кулланыгыз һәм киләсе кеше шул ук тәртипне кабатлый алсын өчен бланкка языгыз.

Санау бланкы (бастырып алыгыз)

Бу бланк махсус әлеге мәкалә өчен әзерләнгән. Аны дәфтәргә күчерегез яки һәр үрнәк өчен бер данә бастырып алыгыз.

Яшәүгә сәләтлелек (%) = 100 x буялмаган / (буялмаган + куе зәңгәр). mL саен барлык күзәнәкләр саны = N x сыекландыру коэффициенты x 10^4; N камераның билгеләнгән мәйданыннан алына. Нәтиҗә янына буяу вакытын языгыз, чөнки вакыт күрсәтелмәгән яшәүгә сәләтлелек күрсәткечен кабатлап алу мөмкин түгел.

Ни өчен яшәүгә сәләтлелек күрсәткечләре үзгәрә

Беренче комачаулаучы фактор — вакыт, һәм ул ике юнәлештә дә тәэсир итә. Метаболик яктан актив күзәнәкләр буягычны кайтара, шуңа күрә артык иртә бәяләгәндә тере күзәнәкләр әле кайтарылуны тәмамламаган булырга һәм ялгыш үлгән дип саналырга мөмкин. Әмма озак тәэсир итү үзе агулы һәм чыннан да зарарланган зәңгәр күзәнәкләр барлыкка китерә, нәтиҗәдә башта тере булган күзәнәкләр үлем билгесе итеп буяла. Шуңа күрә лабораториядә укыту протоколы 5 минут эчендә бәяләүне таләп итә; бу Висконсинның чүпрә белән укыту протоколында күрсәтелгән. Ышанычлы итеп болай әйтергә мөмкин: метилен зәңгәре белән бәяләү вакытка бәйле, шуңа күрә бер кыска вакыт аралыгын билгеләгез һәм сериядәге һәр үрнәк өчен аны үзгәртмәгез.

Яшәүгә сәләтлелеге түбән булган үрнәкләрдә икенче төрле тайпылыш бар. Стандартлаштырылган ысул кисәтә: яшәүгә сәләтлелек якынча 80% тан түбән булганда, метилен зәңгәре чын күрсәткечне арттырып бәяләргә мөмкин, чөнки буягычны һаман да кайтара алган күзәнәкләр үрчү сәләтен сакламаган булырга мөмкин. Сыра кайнату әдәбиятында да яшәүгә сәләтлелек сизелерлек кимегәндә шундый ук ышанычсызлык тасвирлана. Метилен зәңгәрен тиз, якынча бәяләү ысулы дип карагыз; яшәүгә сәләтлелек түбән булганда кабул ителә торган мөһим карарларны, мәсәлән, культураны яңадан ачытуга кертүне, туклыклы агарда колонияләрне санау яки өстәмә буяу белән раслагыз.

Өченче фактор — үрнәк матрицасының йогынтысы. OIV ысулы pH 4.6 тирәсендә үткәрелә һәм түбән pH лы, көчле буферланган үрнәкләр буягычның дөрес эшләвенә комачаулый дип кисәтә. Шул ук вакытта шикәр күләме 100 g/L дан югары булганда бу тестны кулланмаска киңәш итә, чөнки күзәнәкләр ялгыш нәтиҗә бирә торган ачык зәңгәр булып күренә. Буяу вакытындагы pH ны эксперименталь чагыштыру сынап каралган диапазонда сизгерлекнең сизелерлек үзгәрүен күрсәткән; бу метилен зәңгәре ысулының pH ка бәйлелеген тикшерү белән дә туры килә. Калдыклар — аерым тозак: пычрак ачыту катнашмаларындагы буялган кисәкчекләр үлгән күзәнәкләргә охшый һәм операторлар арасындагы аерманы арттыра.

Бу үзгәрүчәнлек аерым күзәтүләр генә түгел, саннар белән дә билгеләнгән. FEMS чүпрә ысулларын чагыштыруда хәбәр ителгән алты айлык сыра җитештерү сынавында метилен зәңгәре белән кабат үлчәүләрнең стандарт тайпылышы уртача 6.1% булган, ә оксонол белән агымлы цитометриядә — 0.2%; ике операторның бер үк үрнәк өчен нәтиҗәләре 13 процент пунктына кадәр аерылган. 2023 елгы яшәүгә сәләтлелек ысулларын санлы чагыштыру флуоресцент микроскопиянең һәм агымлы цитометриянең шактый төгәлрәк булуын ачыклаган, шул ук вакытта ысулның нәтиҗәлелеге төргә һәм матрицага бәйле икәнен күрсәткән. Painting һәм Kirsop тарафыннан язылган классик ысул тасвирламасы (PMID 24430080) төп белешмә булып кала, ә киңрәк чүпрәнең яшәүгә сәләтлелеген һәм активлыгын тикшерү ысулларына күзәтү (PMID 25154541) метилен зәңгәрен хәлиткеч түгел, ә бер-берсен тулыландыручы тестлар рәтенә куя. Монда трипан зәңгәрен куллану үзеннән-үзе яхшырак нәтиҗә бирми: ул мембрана бөтенлегенең югалуын күрсәтә, ә метилен зәңгәре буягычның күзәнәккә үтеп керүен һәм кайтару активлыгын күрсәтә. Шуңа күрә стресс кичергән күзәнәкләр бу ике буягыч белән төрлечә бәяләнергә мөмкин.

Сулыш алу тәҗрибәсе: зәңгәр төснең югалу вакытын үлчәү

Икенче тестта микроскоп аша бөтенләй карамыйлар. Чүпрә, глюкоза һәм сыекландырылган метилен зәңгәре ябык пробиркага салына, ә сәгать зәңгәр төснең югалуына күпме вакыт кирәк булуын үлчи. Метаболизм барышында күзәнәкләр кайтаручы эквивалентлар тудыра, алар зәңгәр буягычны төссез формага әйләндерә; эремәдәге кислород исә аны кире оксидлаштыра. Күзәнәкләр кислород күләмен киметкәч, гомуми кайтарылу өстенлек ала һәм пробирка төссезләнә. Димәк, ахыргы нокта сулыш алу, буягыч концентрациясе һәм кислородның булуы арасындагы балансны чагылдыра. Аны молекуляр кислородны турыдан-туры куллану тизлеге дип түгел, ә метилен зәңгәренең кайтарылу яки төссезләнү вакыты дип күрсәтергә кирәк.

Вакытны уңайлы аралыкта үлчи алу өчен, яшәүгә сәләтлелекне тикшерүдәгегә караганда күпкә сыекландырылган буягыч кулланыгыз. AQA A level мәҗбүри практик эшләр кулланмасы моны яхшы стандартлаштыра: якынча 30 C га кадәр җылытылган һәр 100 mL суга 1 g глюкоза, кулланыр алдыннан ук кушылган 5 g киптерелгән чүпрә һәм 1% башлангыч эремәнең 0.1 mL күләмен 100 mL га кадәр сыекландырып әзерләнгән якынча 0.001% эшче буягыч эремәсе. 2 mL чүпрә-глюкоза суспензиясен 2 mL эшче буягыч эремәсе белән кушыгыз, сынау температурасында тигезләнешкә китерегез, бер тапкыр 10 секунд селкетегез, таймерны кабызыгыз һәм яңадан селкетмәгез. Селкетү кислородны яңадан кертә һәм пробирканы кабат зәңгәрләндерә; бу — процедурадагы иң зур артефакт. AQA билгеләп үткәнчә, әзер катнашма гадәттә 35 C да якынча 5 минут эчендә төссезләнергә тиеш; сынауларның уртача вакыты 20 C да 275 s, 35 C да 128 s һәм 45 C да 145 s булган. Болар — бер конкрет тәҗрибәдән алынган мисаллар, универсаль эталоннар түгел. Контрольдә тотылган шартларда кайтарылу тизлеге белән метаболик яктан актив чүпрә арасындагы санлы бәйләнеш махсус кайтарылу тикшеренүләре белән раслана; алар арасында PMID 25773544 буларак индексланган эш һәм Yeast (2014) басмасындагы механизмны тикшерү дә бар.

Вакыт буенча үзгәрешне күрсәтү (махсус әзерләнгән материал)

Түбәндәге таблица — бу мәкалә өчен махсус әзерләнгән күрсәтмә мисал. Ул югарыда тасвирланган AQA тибындагы тәртипкә нигезләнә: 2 mL чүпрә-глюкоза катнашмасына якынча 0.001% лы 2 mL эшче буягыч эремәсе кушыла, бер тапкыр 10 секунд селкетелә, аннары селкетмичә инкубацияләнә. Мәгълүматлар студентлар төркеме теркәргә тиешле форматтагы үрнәк күрсәткечләр итеп бирелгән; тизлек индексы 1 не секундлардагы төссезләнү вакытына бүлү белән билгеләнә. Шул ук пробиркалар белән тәҗрибә үткәрегез һәм бу язмаларны үлчәнгән кыйммәтләр белән алыштырыгыз.

A, B һәм C пробиркалары өчен тизлек индексының температурага бәйлелек графигын төзегез. Кәкре башта күтәрелә, аннары тигезләнә яки төшә; бу — ферментларга бәйле процесс өчен көтелгән күренеш, туры сызык түгел. D, E һәм F пробиркалары ул кәкредәге мәгълүмат нокталары түгел. Алар — кәкрене аңлатырга мөмкинлек бирә торган контроль үрнәкләр.

Һәр тестка мәгънә бирә торган контроль үрнәкләр

Сулыш алу буенча һәр сынауга өч өстәмә үрнәк кирәк. Кайнатылган яки үтерелгән чүпрә, глюкоза һәм буягыч катнашмасы зәңгәр булып калырга тиеш; бу тиз кайтарылуның тере күзәнәкләр метаболизмына бәйле булуын раслый. Өстәмә глюкозасыз тере чүпрә һәм буягыч катнашмасы — субстрат контроле, әмма барыбер акрын төссезләнү көтегез, чөнки чүпрә эчке запасларын куллана. Чүпрәсез глюкоза һәм буягыч катнашмасы — химик буш үрнәк; ул мөһим, чөнки селтеле шартларда глюкоза бернинди күзәнәк булмаса да метилен зәңгәрен кайтара ала.

Яшәүгә сәләтлелекне санауга башка төрле контроль кирәк: процедураның даимилеге. Бер үк башлангыч буягыч эремәсе, бер үк катнаштыру нисбәте, бер үк буяу вакыты, бер үк камера мәйданы, бөреләр һәм чикләр өчен бер үк кагыйдәләр; мөмкин булганда, үрнәк турында мәгълүматны белмичә санау. Ике операторның нәтиҗәләре ун процент пунктына аерылса, бланк гадәттә сәбәпне күрсәтә: төрле вакыт, зәңгәр төсне бәяләүнең төрле чиге яки бөреләр өчен төрле кагыйдәләр. Буялган күзәнәкләрне әзерләү һәм карау алымнары бактерияләрне гади буяу ысуллары белән бәйле, ә буягычның төрле үрнәкләрдә нәрсәне билгеләвенә киңрәк күзәтү микроскопик буяу атласында бирелгән. Зәңгәр төснең теләсә нинди интенсивлыгын санлы бәяләү нигезендәге физиканы аңлату өчен, шартлары күрсәтелгән йотылу белешмәсе ни өчен һәр коэффициент белән бергә аның эреткече, pH ы һәм концентрация шартлары да бирелергә тиешлеген аңлата.

Тестны сорауга карап сайлагыз. Хәзер ничә күзәнәк тере — бу санау соравы; аңа микроскоп һәм бланк ярдәмендә җавап бирәләр. Бу культура никадәр актив сулыш ала — бу кинетик сорау; аңа секундомер һәм контрольдә тотылган пробиркалар белән җавап бирәләр. Метилен зәңгәре икесенә дә хезмәт итә, әмма бер үк вакытта бер үк пробиркада түгел.